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【6h】

RGD13肽抑制OPN诱导的血管平滑肌细胞黏附与迁移

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综述 整合素在心血管疾病中的作用

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摘要

目的：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）具有收缩型与合成型两种表型。血管损伤时，血流动力学发生改变及局部细胞因子释放，管壁各层细胞成分发生变化，中膜VSMC由收缩型转化为合成型，并大量增殖，导致管腔狭窄。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种分泌型的糖基化磷蛋白，是VSMC由收缩表型向合成表型转化的标志。OPN通过RGD序列与细胞表面的多种整合素受体，如αvβ3、αvβ5，αvβ1等相互作用而调节细胞黏附、迁移、增殖等多种生物学行为。而合成肽SVVYGLR已被证明在多种炎性反应如类风湿性关节炎中起治疗作用。因此，我室设计合成具有以上两种黏附基序的13肽分子-GRGDSVVYGLRSK-，以此作为诱骗寡肽阻断OPN与整合素的相互作用，观察其在OPN诱导的血管平滑肌细胞黏附与迁移中的抑制作用，并初步探讨其机理。
　　 方法：通过黏附、迁移实验观察RGD13肽对细胞黏附、迁移活性的抑制效应；免疫荧光定位分析观察RGD对OPN诱导的VSMC黏着斑形成的影响；Western blot和免疫沉淀分析检测RGD对OPN诱导的ILK去磷酸化的作用；RT-PCR、Western blot和酶图分析检测RGD对OPN诱导的MMP-2表达和活性的影响。
　　 结果：
　　 1 OPN和RGD对VSMC增殖活性的影响。
　　 MTT分析结果表明，不同浓度的OPN（20、40、80μg/mL）对VSMC增殖活性具有轻度的诱导作用，且呈剂量依赖性。当用不同浓度的RGD13肽预孵育后，则OPN诱导的VSMC增殖活性被抑制。10μg/mL的RGD13肽可完全消除OPN的促增殖效应。
　　 2 RGD抑制OPN诱导的VSMC黏附。
　　 细胞黏附分析结果表明，OPN可剂量依赖性的提高VSMC的黏附活性，当OPN浓度达到20μg/mL时VSMC黏附活性较对照组有明显升高（P<0.05）。用RGD预孵育VSMC1 h后，VSMC在OPN包被孔板上的黏附受到抑制；RGD对细胞粘附活性的抑制效应具有剂量依赖性。结果提示，RGD可阻断OPN诱导的VSMC黏附。
　　 3 RGD抑制OPN诱导的VSMC粘着斑形成。
　　 以整合素耦联激酶（ILK）为标志物，用免疫荧光分析观察黏着斑的形成，结果显示，未经OPN处理的VSMC用ILK单克隆抗体进行免疫荧光染色后，胞质内出现散在点状分布的细小荧光颗粒；细胞经20μg/mL OPN孵育5、10、30、60 min后，胞质内的荧光颗粒逐渐增多、形成束状整齐排列的黏着斑轮廓；用RGD（5μg/mL）预孵育1 h后再经OPN处理的VSMC，其胞质内荧光颗粒减少，荧光强度变弱，表明黏着斑形成受到抑制。
　　 4 RGD抑制OPN诱导的ILK去磷酸化作用。
　　 已经证实，在OPN促细胞黏附信号的跨膜转导中，伴有ILK的脱磷酸化。免疫沉淀和Western印迹分析结果显示，在静止期细胞中ILK的苏氨酸磷酸化水平较高，OPN刺激使其磷酸化程度下降，至30 min时降到最低，与对照组比较，磷酸化的ILK降低55.4％。经过RGD预孵育1h后，随着RGD浓度的增高，OPN诱导的ILK去磷酸化作用被消除。提示RGD可阻断OPN信号的跨膜传导。
　　 5 RGD抑制OPN诱导的VSMC迁移。
　　 伤口愈合实验显示，OPN可以提高VSMC的迁移活性。RGD预孵育后，OPN诱导的VSMC迁移被抑制；在所观察的浓度范围内，10μg/mL RGD对OPN诱导的VSMC迁移的抑制作用最强。与对照组相比，RGD使VSMC平面迁移和跨膜迁移活性分别降低57％和52％。由此，RGD对OPN诱导的VSMC迁移具有显著的抑制作用。
　　 6 OPN诱导MMP-2表达和活性。
　　 基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases2，MMP-2）在VSMC迁移中发挥着重要的作用，为了阐明OPN诱导VSMC迁移是否与调节MMP-2活性有关，我们检测了OPN对该基因表达的影响。Western blot和RT-PCR结果显示，OPN可以剂量依赖性和时间依赖性地诱导MMP-2的表达。酶图分析显示，在同样条件下，MMP-2酶活性也平行升高。结果表明，OPN诱导VSMC的迁移与提高MMP-2的表达和活性有关。
　　 7 RGD抑制OPN诱导的MMP-2表达和活性。
　　 Western blot和RT-PCR结果显示，不同浓度的RGD预孵育VSMC1 h后，能够消除OPN诱导的VSMC中MMP-2的表达。在所观察的浓度范围内，10μg/mL ROD对OPN诱导的MMP-2表达的抑制作用最强。与对照组相比，RGD预处理后，OPN诱导的MMP-2的mRNA和蛋白表达水平分别降低了68％和59％。此外，酶图分析可见，RGD预孵育也明显降低MMP-2水解明胶的活性。结果提示，RGD抑制OPN诱导的VSMC迁移活性与降低MMP-2的表达和活性相关。
　　 结论：
　　 1 RGD可以剂量依赖性抑制OPN诱导的VSMC黏附。
　　 2 RGD抑制OPN诱导的黏着斑的形成。
　　 3 RGD可消除OPN诱导的ILK去磷酸化效应。
　　 4 RGD剂量依赖性抑制OPN诱导的VSMC迁移。
　　 5 RGD可以拮抗OPN诱导的MMP-2的表达及活性。

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