逆转录病毒介导的白细胞介素23对小鼠乳腺癌抑瘤作用的免疫机制研究

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目的：将鼠IL-23(mIL-23)基因转染小鼠乳腺癌细胞(MA-891)，建立分泌IL-23的肿瘤细胞株(IL-23/MA-891)，研究IL-23/MA-891细胞通过分泌IL-23发挥的抗肿瘤效应及其免疫学调节机制。方法： 1.将携带mIL-23基因的逆转录病毒载体(LXSN/IL-23)经ψ2和PA317细胞包装成含mIL-23基因的逆转录病毒，再利用该病毒将mIL-23基因导入MA-891细胞，经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆IL-23/MA-891。用RT-PCR法检测IL-23/MA-891细胞IL-23基因的表达；用细胞免疫组化法检测IL-23/MA-891细胞中IL-23蛋白的表达；用ELISA法检测IL-23/MA-891细胞分泌mIL-23的水平及mIL-23诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的情况；用MTT比色法检测肿瘤细胞的体外增殖；流式细胞术检测细胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86分子的表达。 2.将IL-23/MA-891细胞、空载体转染细胞(LXSN/MA-891)和野生型MA-891细胞分别接种于津白Ⅱ号(TA-2)小鼠皮下，于接种肿瘤细胞后30天分别处死每组小鼠各3只，取出肿瘤组织和脾脏备用。各组其余7只小鼠用于观察生存期和肿瘤大小。用ELISA法检测3组小鼠脾细胞在体外经MA-891诱导下，IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的产生情况。用流式细胞术检测肿瘤组织中细胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD86分子的表达，检测脾细胞CD11c阳性细胞的比率，并对脾细胞中CD4+、CD8+T细胞进行检测：用免疫组织化学技术对3组肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞浸润情况进行检测。结果： 1.mIL-23转染MA-891细胞株的建立：将携带mIL-23基因的逆转录病毒载体(LXSN/IL-23)，经过ψ2和PA317细胞的两次包装，产生含mIL-23基因的逆转录病毒，利用该逆转录病毒将mIL-23基因导入MA-891细胞，经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆IL-23/MA-891。经RT-PCR和ELISA法检测结果显示，IL-23/MA-891细胞表达mIL-23mRNA，并分泌高水平mIL-23(136.5±2.8ng/L)，该结果证明，外源mIL-23基因已整合到MA-891细胞基因组中。 2.IL-23/MA-891细胞的生物学性状：在Con A存在下，IL-23/MA-891细胞的培养上清可诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ(28.5±2.7ng/L)，明显高于空载体转染细胞LXSN/MA-891和野生型MA-891细胞培养上清作用脾细胞的IFN-γ产生量(5.1±0.3 ng/L和4.7±0.6ng/L)。IL-23/MA-891细胞在体外培养时的细胞形态和生长速度与LXSN/MA-891和MA-891细胞相比无明显差别。IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891三种细胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD86分子的表达水平无显著性差异。 3.IL-23的体内抗肿瘤作用：IL-23/MA-891、LXSN/MA-891及野生型MA-891细胞在小鼠体内的成瘤率均为100％，但IL-23/MA-891细胞在小鼠皮下的生长速度明显慢于LXSN/MA-891及野生型MA-891细胞；接种IL-23/MA-891细胞小鼠的生存期>120天；接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠肿瘤生长速度相似，平均生存期分别为50±3天和51±3天。 4.脾细胞产生细胞因子情况：接种IL-23/MA-891细胞的小鼠脾细胞可产生较高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12等Th1类及相关细胞因子，与接种LXSN/MA-891和MA-891细胞两组小鼠相比明显增高，而产生Th2类细胞因子如IL-4的水平却无明显差异。 5.对脾细胞中CD11c阳性细胞和CD4+、CD8+T细胞亚群的影响：接种IL-23/MA-891细胞组小鼠的脾细胞中，CD11c阳性细胞比率(21.4±1.6％)，与接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠相比(12.4±1.0％和11.6±0.6％)显著增高；接种IL-23/MA-891细胞组小鼠脾细胞中CD4+及CD8+T细胞比率(34.0±1.7％，14.6±0.6％)均较接种LXSN/MA-891细胞(12.3±0.8％，9.1±0.5％)和MA-891细胞(12.5±0.7％，9.0±0.6％)组小鼠显著增高。 6.肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞的浸润：免疫组化分析结果显示，接种IL-23/MA-891细胞小鼠的肿瘤组织中，CD4+、CD8+T细胞浸润程度较接种LXSN/MA-891和MA-891细胞小鼠有明显增加。 7.肿瘤组织中细胞表面分子表达的变化：经流式细胞术分析结果显示，与接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组相比，接种IL-23/MA-891组小鼠肿瘤组织细胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD86分子表达水平显著提高。结论：mIL-23基因导入MA-891细胞所构建的IL-23/MA-891细胞能够分泌高水平mIL-23，外源性IL-23基因的插入对MA-891细胞的体外生长及生物学性状均无明显影响。IL-23/MA-891细胞的培养上清可诱导小鼠脾细胞分泌较高水平IFN-γ，具有明显的生物学活性。转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞所分泌的IL-23在小鼠体内发挥了明显的抗肿瘤作用。增加了肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞的浸润数量，促进了小鼠脾细胞产生IFN-γ、TNF-α和IL-12等Th1类及相关细胞因子的分泌，增强了细胞免疫功能；IL-23还可通过增加树突状细胞的数量，增强肿瘤的抗原性及抗原提呈协同刺激作用，防止肿瘤逃逸，发挥抗肿瘤作用。

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作者
冯永路;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名单保恩,艾军;
年度 2008
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类乳腺肿瘤;
关键词
乳腺癌; 抑瘤作用; 免疫机制; 逆转录病毒载体; 白细胞介素;

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