p73、PTEN基因多态性及其启动子区CpG岛高甲基化与食管癌生物学行为的相关性研究

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目的：我国是食管癌的高发国家，特别是河北省南部与河南省北部，食管癌病死率为全球最高的地区之一。现已公认，早期发现、早期诊断、早期治疗是提高食管癌生存率的主要措施，但早期癌发病隐匿，不易发现，是食管癌患者不能及时治疗的主要原因。近年来，随着恶性肿瘤发生的分子生物学机制研究的进展，认为恶性肿瘤的发生主要涉及两大机制：一是遗传学机制，即：DNA序列的异常改变。另一个是表遗传学机制，即DNA的基因外修饰，其主要形式是甲基化改变。基因的异常甲基化，即抑癌基因的高甲基化与癌基因的去甲基化被认为是抑癌基因失活和癌基因激活的主要机制。与突变等基因改变不同，基因的甲基化状态是可逆的，这对肿瘤的防治尤为重要。p73和 PTEN 基因是两种重要的肿瘤抑制基因，可通过不同的方式调控细胞周期、抑制细胞增殖及诱导凋亡，参与肿瘤的发生、发展。有研究表明p73基因G4C14-A4T14、-386G/A和PTEN 基因-9C/G、IVS4-/+多态性与多种肿瘤和其它疾病的易感性有关；而p73和PTEN 基因的高甲基化也在许多肿瘤的形成中起重要作用。因此本研究首先分析p73基因G4C14-A4T14、-386G/A和 PTEN 基因-9C/G、IVS4-/+多态性在河北省食管癌高发区正常人群和食管癌患者中的分布，探讨其与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcillOITla，ESCC)易感性的关系；其次检测食管癌组织中p73和PTEN基因的甲基化状态，分析其与ESCC生物学行为的关系；进一步检测食管癌组织中p73和 PTEN 基因mRNA 表达情况及其临床意义。分别从遗传学角度—基因多态性、表遗传学角度—基因甲基化、转录水平—基因mRNA表达，来阐述p73和 PTEN基因在食管癌发生中的作用，探讨个体对食管癌的易感机制和食管癌发生、发展的分子机制，为食管癌的预防和治疗提供理论依据。方法： 1．采用基于人群的病例-对照研究方法，收集河北省磁县和涉县 348例食管癌患者和 624 例健康对照个体的静脉抗凝血，同时记录其病史、个人史、肿瘤家族史。以蛋白酶K消化一饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA，采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态(polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法检测ESCC患者和健康对照者的p73 G4C14-A4T14、-386G/A和PTEN-9C/G、IVS4-/+多态的基因分型。以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别及吸烟状态、家族史校正的相对风险度的比值LL(odds ratio，OR)及其95％可信区间(95％confidence interval，9s％CI)。 2．收集94例ESCC患者的食管病变组织及94例ESCC患者相应的食管正常组织，采用酚氯仿法抽提组织DNA并进行亚硫酸盐处理，采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSP)的方法，对其分别进行p73和PTEN基因启动子区的甲基化状态检测，分析其与食管癌发病、淋巴结转移、浸润深度、及临床病理分期的关系。 3．应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法检测94例ESCC肿瘤组织及相应正常组织的p73和PTEN 基因mRNA表达情况，采用相对定量分析计算各组基因表达相对系数的均数(x±s)，并分析其与食管癌发病、淋巴结转移、浸润深度、及临床病理分期的关系。 4．采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法检测94例ESCC患者p73 G4C14/A4T14和PTEN IVS4-/+多态的基因型。采用MSP 的方法检测ESCC组织p73和PTEN 基因启动子区的甲基化状态；同时应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法定性检测ESCC组织p73和 PTEN 基因mRNA表达。分析p73 G4C14/A4T14和PTENIVS4-/+多态性与其基因mRNA表达关系；分析p73和PTEN基因启动子区的甲基化状态与其基因mRNA表达关系。结论： 1．上消化道肿瘤家族史明显增加河北省食管癌高发区人群ESCC 的发病风险。 2．与p73 GC/GC基因型相比，p73 GC/AT和AT/AT基因型均不影响中国河北省食管癌高发区人群ESCC的发病风险。同样，与p73 -386A/A基因型相比，p73 -386G/A和-386G/G基因型也不影响该地区人群ESCC的发病风险。 3．p73 G4C14-A4T14和-386G/A多态位点不存在连锁不平衡。与G4C14/-386A单体型相比，G4C14/-386G、A4T14/-386A和A4T14/-386G单体型不影响食管癌高发区人群ESCC 的发病风险。 4．与PTEN-9C/C基因型相比，携带G等位基因(即G/C+G/G基因型)不影响中国河北省食管癌高发区人群 ESCC 的发病风险。然而与PTENIVS4-/-基因型相比，PTEN IVS4+/+基因型可以降低该地区人群ESCC 的发病风险，是食管癌发生的保护性因素。 5．PTEN -9G/G和IVS4-/+多态位点存在部分连锁不平衡，-9C 等位基因与IVS4+等位基因部分连锁。与-9C/IVS4+单体型相比，-9C/IVS4-单体型增加中国河北省食管癌高发区人群ESCC 的发病风险。 6．p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4-/+多态性在河北省食管癌高发区人群ESCC 发病过程中没有协同作用。 7．食管癌组织中p73基因的高甲基化频率较低，其基因的高甲基化与食管癌的发生无关。并且p73基因的高甲基化与食管癌组织的浸润深度、临床病理分期及淋巴结转移无关。提示p73基因的甲基化不是食管癌发生、发展的主要事件。 8．食管癌组织中PTEN 基因的高甲基化频率较高，并且其基因的高甲基化与食管癌的发生密切相关。虽然，PTEN 基因的甲基化状况与食管癌组织的浸润深度、临床病理分期无关，但是，PTEN 基因甲基化与食管癌的淋巴结转移密切相关，淋巴结转移阳性组PTEN 基因甲基化频率显著性高于淋巴结转移阴性组，提示PTEN 基因高甲基化可能与食管癌的预后不良有关。 9．p73基因mRNA高表达可能在食管癌上皮癌变过程中起作用，而PTEN 基因的低表达可能与食管癌发生密切相关。p73和 PTEN 基因的mRNA 表达与食管癌淋巴结转移、食管癌侵及深度、临床病理分期均无关。 10．在食管癌中，p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4-/+多态性与其基因mRNA 表达无关，提示这两个多态可能不影响其基因表达。 11．食管癌中，p73mRNA 表达与其基因甲基化状况无关；在PTEN基因失表达个体中，PTEN 基因甲基化频率显著升高，PTEN mRNA 失表达与其基因甲基化密切相关，提示PTEN基因甲基化引起其mRNA失表达，进而导致食管癌的发生。

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作者
葛晖;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科外科学
授予学位博士
导师姓名张健慧;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类食管肿瘤;肿瘤病因学、发生学;
关键词
食管鳞状细胞癌; p73基因; PTEN基因; 多态性; 肿瘤易感性; 异常甲基化; mRNA表达;

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