大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞两种方法比较的实验研究

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目的：骨髓基质细胞(MSCs)是存在于骨髓中除造血干细胞之外的另外一种干细胞，它不仅具有强大的增殖能力，在体外扩增可获得大量子代细胞，同时具有多向分化潜能，在一定条件下不仅可分化为中胚层起源的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，还可分化为外胚层起源的神经细胞，更为重要的是，它具有胚胎干细胞及神经干细胞无法比拟的优势：自体MSCs易于获得，可大量扩增，自体移植无免疫排斥反应，无伦理道德方面的限制，并且还可能避免了产生肿瘤的危险。MSCs有望成为治疗神经系统疾病的理想的种子细胞。为了寻找更为理想的诱导MSCs分化为神经元样细胞的药物及最佳诱导条件，本试验分别利用三磷酸腺苷(ATP)与神经妥乐平(NT)作为诱导剂，进行观察比较，以期为临床应用MSCs移植治疗神经系统疾病奠定基础。方法： 1.取一月龄SD大鼠，麻醉后无菌条件下，取双侧股骨和胫骨的骨髓，分离出MSCs，用贴壁法培养，并连续传代、扩增，以获取更纯化的MSCs，连续观察细胞生长情况，以了解其生长特性。 2.分别取第2、5、8代细胞，消化后以1×104/ml密度种于24孔板中，每隔24h按顺序检测3个孔的细胞数，并计算3个孔细胞平均数，连续观察10d，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，分别绘制生长曲线，并分别计算出MSCs在对数生长期的群体倍增时间(PDT)和整个增殖期平均的PDT以及增殖后所得到的MSCs的理论数值。 3.分别用ATP与NT为诱导剂对MSCs进行诱导，比较不同浓度NT对MSCs的诱导作用。 3.1NT的终浓度分为：0.5mu/ml、1mu/ml、1.75mu/ml、2.5mu/ml、5mu/ml，诱导后分别做巢蛋白(Nestine)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫细胞化学染色，计算阳性细胞比例进行统计学分析，选出最佳诱导浓度。 3.2ATP的终浓度采用刘文忠报道的50ug/ml进行诱导。 3.3分别观察ATP与NT在最佳诱导浓度时不同时间对MSCs的诱导作用。诱导时间可分为：1d、3d、5d、7d、10d，诱导后进行免疫细胞化学染色进行检测，计算出阳性细胞比例，进行统计学分析，找出两药各自的最佳诱导时间。 3.4对ATP与NT各自于最佳条件下诱导出的阳性细胞数进行统计学分析，比较两者对MSCs的诱导作用。结论： 1.MSCs在体外培养条件下具有强大的增殖能力，且生长特性稳定；MSCs在一定条件下可向神经元样细胞分化，更进一步证明了其具有多向分化潜能。 2.NT与ATP在体外均具有诱导MSCs向神经元方向分化的作用，且NT的诱导作用优于ATP，故NT是一种很好的诱导MSCs向神经元样细胞分化的药物。 3.MSCs向神经元样细胞转化过程中要经过神经前体细胞(其标志物为Nestine表达阳性)，再转化为神经元样细胞。

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作者
薛海菊;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名李育臣;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类神经病治疗学;
关键词
骨髓基质细胞; 诱导分化; 神经元; 神经妥乐平; 三磷酸腺苷;

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