RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

背景：复杂的信号网络在细胞生长、衰老、死亡等多种生命活动中起着重要的调节作用，这些信号网络的形成是由具有一定特异性的相对少量的信号分子(即支架蛋白)来完成的。激活的蛋白激酶C受体1（RACK1，基因名Gnb2l1）就是这样的一种支架蛋白。RACK1分子量为36kDa，含有7个WD40重复序列，与G蛋白β亚基具有高同源性，在信号传导过程中可以作为锚定蛋白和穿梭蛋白以参与信号的传导或活化。大量研究表明RACK1在肝细胞癌等肿瘤的恶性生长中有着重要促进作用。而且RACK1在肝组织中高水平表达，但其在肝脏中的病理生理作用还是未知的。自噬是一个高度保守的细胞固有的生命进程，这个过程中，细胞的一些多余的成分或衰老的器官被转运到溶酶体降解或者分解。以此作为机体重要的降解去路而存在。在肝脏中，自噬促进脂肪降解，有利于脂代谢稳态的维持。自噬的启动自噬的启动需要AMPK活化或mTOR活性受抑导致的ULK1活化，接着ULK1磷酸化Beclin1导致自噬起始复合体ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15形成，MAPK家族成员JNK对Bcl2的磷酸化促使Bcl2与Beclin1解离，也有利于自噬起始复合体形成。Class III PI3K VPS34(也称为PIK3C3)激酶活性在复合物形成后升高，催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成，招募DFCP1形成Omega小体，进而ATG12-ATG5共价结合，促进膜延伸和闭合，诱导LC3B从胞浆型（LC3B I）转变为膜型（LC3B II）、促进自噬体的形成。但是自噬起始复合体的形成机制还不清楚。我们的研究发现，RACK1对自噬有促进性作用，并且参与自噬起始复合体的形成，RACK1缺失导致肝细胞脂肪堆积。这将为自噬的相关机制的研究和脂肪肝的治疗方面的探索提供一些依据。
　　目的：在肝来源细胞中探索RACK1对自噬是否有影响；探讨RACK1预防肝细胞脂肪堆积的作用；分析RACK1影响自噬的分子机制。
　　方法：以饥饿或mTOR抑制因子处理诱导自噬，以氯喹阻断溶酶体活性；在上述处理前后通过Western Blot检测自噬相关指标LC3B II和ATG12-ATG5等的表达；透射电镜观察饥饿诱导自噬小体和脂肪滴的形成；Nile red染色分析脂肪堆积；免疫荧光分析DFCP1 Opuncta的形成；激酶活性分析的方法检测VPS34活性；免疫沉淀与银染、质谱鉴定相结合寻找RACK1相互作用蛋白；利用免疫共沉淀的方法验证RACK1和自噬起始复合体ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15之间的相互作用；利用GST-pull down的方法检测体外翻译的自噬起始复合体成分和RACK1的直接结合。
　　结果：⑴在肝来源细胞系中敲低内源RACK1的表达，自噬标志物LC3B II的本底水平和饥饿诱导的LC3B II生成显著降低。RACK1敲低的情况下，mTOR抑制因子和/或氯喹作用后的LC3B II水平也降低，说明LC3B II水平下降的原因是自噬减少而不是溶酶体活性过强。Western Blot鉴定Gnb2l1F/F;Alb-Cre(即Gnb2l1?hep)小鼠表明，RACK1在肝细胞中的表达缺失，但在其它组织中的表达与对照Gnb2l1F/F小鼠无差异。Gnb2l1?hep小鼠从生后4个月起肝脏变大、变黄；透射电镜下可见6周大Gnb2l1?hep小鼠的肝细胞脂肪滴增多而糖原减少、线粒体数量增多但体积变小；饥饿48小时后，Gnb2l1F/F小鼠肝细胞中出现较多自噬小体，而Gnb2l1?hep小鼠的肝细胞无自噬小体，并且线粒体膨胀、脂肪滴数量和体积增大。Nile Red染色证实了脂肪的堆积。Western Blot表明饥饿前后Gnb2l1?hep小鼠肝组织LC3B II生成均减少,证实RACK1的缺失导致自噬水平的降低。⑵LC3B II的生成依赖于ATG12-ATG5的共价结合，Western Blot表明饥饿前后Gnb2l1?hep小鼠肝组织ATG12-ATG5生成均减少,提示RACK1影响更早期的分子事件。在RACK1敲低的肝来源细胞及其对照细胞中表达GFP-DFCP1，发现RACK1敲低导致DFCP1 Opuncta形成的减少；并且整体VPS34激酶活性或ATG14L相关的VPS34激酶活性均在RACK1敲低或敲除的情况下降低，表明RACK1参与自噬的早期进程。⑶为了进一步揭示RACK1参与自噬的分子机制，我们在RACK1敲低的人肝来源细胞中表达GFP标签的人源RACK1分子，由于GFP-RACK1也受RNA干扰作用的影响，表达量很低，可以作为内源RACK1分子发挥作用。免疫沉淀饥饿前后肝来源细胞中的“内源样”GFP-RACK1分子，经银染和质谱鉴定，发现了一个可能的RACK1结合蛋白VPS15，提示RACK1是自噬起始复合体的一个成分。免疫共沉淀证实了这一推测Gnb2l1?hep小鼠肝组织中，自噬起始复合体的形成显著减少，说明RACK1促进自噬起始复合体的形成。⑷在肝来源的细胞中表达外源的Flag-RACK1和GFP-RACK1，anti-FLAG免疫沉淀物中可以同时检测到两种不同标签的RACK1的存在，并且在饥饿处理后1h时，FLAG-RACK1共结合的GFP-RACK1量升高最为明显。GST-RACK1分别和体外翻译的VPS15、VPS34、ATG14L、Beclin1进行GST-pull down分析，复合物中可以检测到VPS15、ATG14L、Beclin1的存在，表明RACK1直接与ATG14L, Beclin1和VPS15结合。⑸Western Blot表明饥饿前后Gnb2l1?hep小鼠肝组织P-JNK, P-AMPK, P-Ulk1无缺陷。
　　结论：肝细胞中，RACK1能够稳定自噬早期复合物的形成和促进自噬启动，维持正常的自噬功能，从而维持细胞的稳态和抑制脂肪堆积。

著录项

作者
赵亚伟;
展开▼
作者单位

河南大学;

展开▼
授予单位河南大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名马远方,张纪岩;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肝代谢障碍;
关键词
肝代谢障碍; 脂肪堆积; 蛋白激酶C; 细胞病理学;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 自噬调控非酒精性脂肪肝的分子机制研究进展及中药有效成分对肝脏自噬的作用分析 [J] . 高正睿 ,吴之涛 ,龚永福 . 中国当代医药 . 2019,第031期
2. 自噬的分子机制及其在心脏骤停脑损伤中的作用研究进展 [J] . 胡星平 ,秦开秀 . 现代医学与健康研究 . 2021,第012期
3. 自噬的分子机制及其在糖尿病视网膜病变中的作用 [J] . 孙洪岩 ,滕岩 ,杨明明 . 眼科新进展 . 2019,第010期
4. 自噬在胰岛β细胞存活中的作用及游离脂肪酸对其调控的分子机制研究进展 [J] . 冯晓桃 ,段慧明 ,程永芳 . 山东医药 . 2019,第014期
5. 自噬在肿瘤中作用的分子机制研究进展 [J] . 付婷婷 ,易善永 ,赵玲 . 中华临床医师杂志（电子版） . 2018,第003期
6. 一个新的癌基因LAPTM4B,在促进肝细胞恶性转化中的作用及其作用机制以及潜在的应用前景 [C] . 周柔丽 ,李莉 ,潘艳萍 . 中国抗癌协会第十届全国肝癌学术会议 . 2005
7. 自噬与EMT在亚砷酸钠所致肝细胞恶性转化中的作用及分子机制 [A] . 刘欣璐 . 2017

RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅