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结核病术后局部菌残留/复制与切口延期愈合的关系研究

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1 引言

2、实验材料

2.1 组织标本

2.2 主要试剂

3 实验方法

3.1 荧光定量PCR步骤

3.1.1 首先对标本进行室温解冻

3.1.2 振荡提取样本

3.1.3 加样离心

3.1.4 弃上清

3.1.5 弃上清

3.1.6 弃上清

3.1.7 扩增试剂准备(PCR前准备区)

3.1.8 加样(样本处理区)

3.1.9 PCR扩增(检测区)

3.1.10 循环条件设置

3.1.11 仪器检测通道选择

3.2 细胞因子检测实验步骤

3.2.1 准备96孔平底微孔器

3.2.2 加抗体磁珠

3.2.3 使用手持式磁性洗板器洗磁珠。

3.2.4 加标准品和样本

3.2.5 孵育

3.2.6 使用手持式磁性洗板器洗板

3.2.7 加检测抗体混合物(1x)

3.2.8 洗板

3.2.9 加链霉亲和素-PE(SAPE)

3.2.10 洗板

3.2.11 准备用于Luminex分析的板

4 实验结果

4.1 荧光定量PCR结果

4.2 细胞因子检测结果

5 实验讨论

5.1 IL-6(白细胞介素-6)

5.2 VEGF-A(血管通透性因子)

5.3 PDGF(血小板衍生因子)

5.4 IFN-a(干扰素-a)

5.5 TNF-a(肿瘤坏死因子-a)

6 结论

参考文献

综述:荧光定量PCR在结核杆菌检测中的应用

英文缩略词

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摘要

目的:自上世纪末以来,由于结核病控制工作的忽视、人口流动的逐渐增加、越来越多的耐药结核病、结核病和艾滋病毒合并感染等,结核病在全球范围内复苏,严重危害人类的健康,不仅成为一个严重的公共卫生问题,也成为影响社会和经济发展的重要问题。1993年世界卫生组织(WHO)宣布“结核病全球紧急状态”。我国结核病患者数量在世界上22个结核病高负担国家中位居第二位(印度为第一)。如何在中国开展结核病的防控工作将直接影响到全球结核病控制的战略实现和结果,受到国际社会的广泛关注。
  虽然结核病在发达国家的发病率已明显降低,但是目前仍是许多发展中国家的常见病多发病。因此,在结核病的外科治疗上,发达国家和发展中国家的结核病治疗策略有明显不同。在发展中国家,外科手术仍是治愈结核病的重要治疗手段之一,2-5%肺结核病需要外科治疗才能治愈。随着全球耐药结核病的增加,外科手术干预的重要性越来越显著。结核病的外科治疗已有100多年历史。结核病化疗时代之前,肺结核病的外科治疗以肺萎陷手术为主,如人工气胸、人工气腹、胸廓改型术等。相对于肺结核(TM)而言,肺外结核病(NTM)的外科干预无论从诊断和治疗上都有重要的意义。化疗时代之前,骨关节结核只能做引流术,但由于术后死亡率较高,切口流出白色脓液,所以当时被称为“白色瘟疫”,有“打开结核病灶就是打开死亡之门”之称。上世纪四、五十年代,国内方先之教授的骨结核深部病灶清除术获得成功,使骨结核的术后死亡率明显降低。1959年,吴英凯院士报道,新中国十年来肺结核外科治疗术后并发症是17%,1994年,国内赵兴吉报道肺结核术后并发症发生率9%,2012年,国内一篇报道耐多药肺结核的外科治疗meta分析显示:肺结核术后并发症发生率在15%。主要的并发症是术后切口延期愈合与支气管胸膜瘘导致长期漏气等。其中骨结核、淋巴结核、胸壁结核等肺外结核病术后切口不愈合或延期愈合的并发症更为常见。
  结核病术后切口长期不愈合和窦道形成,主要由于术前未规律抗痨治疗、病灶清除不彻底、手术方式不恰当、手术时机未把握好、未严格按照无菌要求手术等导致的,国内外文献报道,尤其是在肺外结核(NTM)疾病手术后,如淋巴结核、胸壁结核、骨结核、关节结核、脓胸、肾结核、肠结核等切口长期不愈合和窦道形成更为常见。因为肺外结核(NTM)病术后切口愈合时间长等并发症的发生率较高,直接影响结核病的临床疗效和病人及家属的信心。虽然这种现象的机理尚未阐明,但是目前社会上治疗方法纷杂,如中医中药、反复手术、调整抗结核药物等等,但是治疗效果并不明显。查阅国内外文献均没有发现从细菌学、分子生物学角度对结核杆菌病原体与术后切口长期不愈合关系的研究。可以说近60年来,结核病术后切口延期愈合的并发症并未明显降低!这是一个长期困扰医生和患者的世界性难题,以至于在结核病标准化疗、短程化疗、DOTS等结核病化学治疗方案成功、外科手术死亡率明显降低的今天,这个问题依然常见,使大家闻之色变,却又习以为常!
  本研究是近期设计,首先通过结核病引流术或病灶清除术后引流物的理化特性、结核分枝杆菌数量检测、细胞因子检测等,探明局部菌残留/复制与切口延期愈合的关系。将初步探明术后引流物理化特性、结核分枝杆菌数量、细胞因子等与切口延期愈合的关系,并为结核病手术方法选择、术中是否置药、后期动物模型的建立与细胞治疗的研究提供重要依据,其临床意义显著。
  方法:病人入组条件:实验组均为肺外结核病(NTM)病人,如淋巴结核、胸壁结核、脓胸、骨关节结核、肠结核等,术前抗结核治疗至少2周以上,没有其他免疫系统疾病的合并症,非耐多药结核病人及非结核分枝杆菌病人。对照组为I类切口病人,均为甲状腺部分切除及乳腺区段切除手术病人,不合并HIV及其他免疫性疾病。
  临床实验组:随机分为2组,肺外结核病人(NTM)60位,I类切口病人60位。每个病人取样本3-7次。
  手术方法:严格按照无菌操作,结核病灶彻底清除术后,常规依次使用双氧水、碘伏和生理盐水反复冲洗残腔。置放引流管以收取术后不同时间段的引流液。
  收取样本集检测:分别收取术后第6h、12h、24h、3d、5d、7d、9d的引流液。根据病人手术创伤大小不同等多种因素,术后切口能收集到引流液的时间及量不同,则收集标本3-7次不等。本实验选取均至少能够收集5次引流液的患者进行数据分析。
  检测方法:应用荧光定量RT-PCR方法检测术后第6h、12h、24h、3d、5d的引流液中结核杆菌数量(涂片、培养、核酸等);对所收集的术后第6h、12h、24h、3d、5d的标本进行细胞因子(IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-22,TNF-α,IFN-α,IFN-γ,
  EGF、FGF-2,VEGF-A、PDGF-BB十二种细胞因子)测定,分别对所得数据进行分析,观察结核病病灶清除术后结核分枝杆菌数量(涂片、培养、核酸等)及细胞因子对切口愈合的影响。所得实验数据用SPSS17.0统计软件分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。
  结果:对60例肺外结核病人术后第6h、12h、24h、3d、5d所取300例引流液标本进行结核杆菌荧光定量PCR检测。其中25个病人的125例标本经荧光定量PCR方法未被检测到结核杆菌浓度,切口愈合时间平均为36.6天;35个病人的175例标本经荧光定量PCR检测出结核杆菌,且术后切口结核杆菌浓度随着术后时间的延长总体趋势呈逐渐降低,切口愈合时间平均为56.8天;即在结核病围手术期常规应用有效抗结核药物治疗后,结核病术后切口局部结核杆菌的残留浓度与切口愈合时间呈正相关。即切口局部结核杆菌残留浓度低的病人,切口愈合时间短;切口局部结核杆菌残留浓度高的病人,切口愈合时间相对长。用细胞因子检测方法检测结核标本及 I类切口标本中 IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-22,TNF-α,IFN-α,IFN-γ,VEGF-A,EGF、FGF-2,PDGF-BB十二种细胞因子在不同时间段的浓度,分析其变化趋势及异同。得出在肺外结核病及I类切口术后的引流液中IL-6、VEGF-A两种细胞因子的水平均较高;PDGF-BB(77)、IFN-a(48)、TNF-a(45)三种细胞因子在肺外结核标本中的浓度较I类切口标本中的浓度明显低。
  结论:本实验结合国内外文献报道,排除实验系统误差及个人操作误差,由于应用7500 Real-time PCR System,检测灵敏度有限,由于实验组标本中有较多标本的结核杆菌浓度较低超出7500 Real-time PCR System的最低检测限度,这些标本经过荧光定量PCR之后,未被检测出来有效浓度。初步得出结核病术后切口局部结核杆菌的残留浓度与切口愈合时间呈正相关的结论,结核病术后需要长期应用有效抗结核药物以降低切口局部结核菌残留浓度从而达到缩短病人切口愈合的时间。细胞因子检测方法检测结核标本及I类切口标本中IL-6、VEGF-A水平均较高,PDGF-BB(77)、IFN-a(48)、TNF-a(45)在结核标本中的浓度明显较I类切口标本中的浓度低。我们推测PDGF-BB(77)、IFN-a(48)、TNF-a(45)这三种细胞因子与结核病术后切口延期愈合可能有关系。为后期通过大鼠软组织结核病模型的构建,探明利用局部用药降低菌量对术口愈合的影响,以及利用相关细胞因子进行免疫治疗,以反面证明其与结核病术后切口延期愈合的关系。为后期研究中结核病术后切口延期愈合的细胞治疗奠定了坚实的基础。

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