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miRNAs在LPS诱导乳腺上皮细胞中炎性反应中的表达及miR-223参与调控Toll样受体信号通路_初探

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1 文献综述

1.1 miRNAs简介及其在乳腺炎症反应中作用的研究进展

1.2 LPS引起大肠杆菌型乳房炎的信号转导通路的研究

1.3 miRNAs参与Toll样受体信号通路的负性调控

1.4 miRNAs表达载体构建的研究

1.5 展望

2 引 言

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 主要试剂

3.3 试验仪器

3.4 试剂配制

3.5 miRNAs在LPS诱导EpH4-Ev细胞炎性反应中的表达

3.6 微环Mini-miR-223、PB-miR-223和pcD-miR-223真核表达载体的构建

3.7 miR-223重组质粒在EpH4-Ev细胞中的表达

3.8 miR-223inhibitor靶向抑制miR-223基因的表达

3.9 miR-223对 LPS/TLR4 信号通路的影响

3.10 Western blot 分析

4 结果与分析

4.1 miRNAs在LPS诱导EpH4-Ev细胞炎性反应中的表达

4.2 微环Mini-miR-223、PB-miR-223和pcD-miR-223真核表达载体的构建

4.3 miR-223 inhibitor靶向抑制miR-223的表达

4.4 miR-223对TLR4 信号通路的影响

4.5 Western blot分析

5 讨论与结论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

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摘要

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非蛋白编码的单链小RNA，大小约20~25nt，具有高度保守性、时序表达特异性，其表达受到严格的调控。miRNA通过直接结合到靶mRNA分子的3'非翻译区(3'untranslated regions,UTRs)，进行互补配对，抑制靶mRNA的转录、翻译或诱导其降解，从而在转录后水平调节基因的表达。研究表明miRNAs参与众多生理疾病过程的调控，其表达的紊乱与疾病发生的机制密切相关。反刍动物乳房炎(mastitis)，尤其是奶牛乳房炎(bovine mastitis)是世界范围内迄今为止仍未得到有效解决的顽疾，严重影响了养殖业和乳业的发展。已有研究表明，miRNAs在乳腺炎症反应过程中的表达有明显变化，可能参与了乳腺炎症反应的调控，但具体机制尚不明确。本研究旨在明确炎症若干相关的miRNAs在LPS诱导的乳腺炎症反应中的表达变化，对miR-223在Toll样受体信号通路中的影响进行初探，为反刍动物乳房炎防治新靶点的发现提供实验依据。
　　本研究以不同浓度剂量的LPS刺激小鼠乳腺上皮(EpH4-Ev)细胞48h，qRT-PCR检测炎症相关miRNAs(miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155)的表达变化。qRT-PCR检测结果表明，LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应48h时，4种炎症相关miRNA的表达均显著增加(P<0.05)，并呈现不同程度的剂量依赖性。利用RT-PCR方法从小鼠乳腺上皮细胞基因组DNA中对pre-miR-223基因进行克隆；构建了以质粒Minicircle、PiggyBac转座子和pcDNA3.1(+)为母本的3种miR-223真核表达载体，将其转染整合到EpH4-Ev细胞，通过观察GFP荧光、qRT-PCR检测miR-223基因在EpH4-Ev细胞中的mRNA表达水平，结果表明成功构建了Mini-miR-223、PB-miR-223和pcD-miR-223三个真核表达载体。
　　为探索miR-223对炎症反应过程中最重要的信号通路—TLR信号通路相关分子的影响，我们将miR-223的过表达载体及miR-223inhibitor转染至EpH4-Ev细胞，qRT-PCR检测TLR信号通路相关分子表达变化，Western blot检测其蛋白水平的变化。实验结果表明，PB重组质粒组过表达miR-223后，与其PB空载组相比，TLR4、NF-кB、IL-6的表达水平有不同程度下调，但无统计学差异；MyD88、TNF-α表达明显下调(P<0.05)；IL-1β表达明显下调，差异极显著(P<0.001)；抑制miR-223的表达后，与上述结果基本相反，说明miR-223基因参与了TLR信号通路相关分子的调控。Western blot结果显示：在过表达miR-223的PB组，IL-6蛋白的含量与其对照组相比，显著下降(P<0.05)，在过表达miR-223的pcDNA3.1(+)组，IL-6蛋白的含量与其对照组相比，有下降趋势，但无统计学意义；NF-кB蛋白的含量在PB和pcDNA3.1(+)两个重组质粒组与各自对照组相比均无明显变化。上述结果提示我们，miR-223可能通过负调控IL-6的表达在TLR信号通路中发挥抑炎作用，但IL-6是否是miR-223的靶基因还需进一步的实验验证。

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