龙胆草斑枯病病原菌的分离纯化及系统鉴定研究

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本实验在总结前人研究基础上，针对黑龙江省地区发生的龙胆斑枯病病原菌进行了系统的研究鉴定，为专属性地防治龙胆草药用植物的病害准确鉴定出病原物，同时也为改进化学农药防治和中药防治等措施奠定了基础，进而提高龙胆单位面积产量。此研究过程中利用传统形态学鉴定、GC-MS气质联用色谱法检测菌株全细胞脂肪酸聚类分析技术、ISSR分子生物学标记技术三大方法进系统地鉴定了来自黑龙江省北安市赵光农场、七台河北方中草药研究所、佳木斯市莲江口农场、黑龙江中医药大学药用植物园四个粗糙龙胆种植地区分离纯化得到的44个龙胆斑枯病病原菌株。首先，对上述四个产地的龙胆斑枯病叶片进行五点法采样，并对整体病害症状进行观察记录；采用病叶组织分离法结合分生孢子悬液纯化法进行分离纯化菌株，对黑龙江省北安、七台河、佳木斯、黑龙江中医药大学药用植物园四个不同地区的龙胆斑枯病病叶进行病原体分离纯化，分别得到15、9、12、8个菌株，总计44株病原菌。传统形态学鉴定在宏观方面主要观察病叶的病斑形状、病斑直径大小、病斑颜色、发斑部位、分生孢子器着生位置；微观方面主要观察分生孢子器和产孢细胞的形态、孢子形态、孢子长度大小、隔膜数。参照国内外关于龙胆斑枯病病原菌研究鉴定情况结合所分离的病原菌形态学观察初步得出结论为：所分离纯化的44个菌株，形态学无显著性差异，依据真菌分类检索表均归为同一个种属，即为半知菌亚门球壳孢目壳针孢属真菌中的小孢壳针孢即为SeptoriamicrosporaSpeg. 其次，由于龙胆斑枯病病原菌属于球壳孢目真菌范畴，传统形态学在此分类鉴定研究上目前已存在很大不足，无法确定龙胆斑枯病病原菌是否存在变异。故利用GC-MS气质联用色谱法检测菌株全细胞脂肪酸聚类分析技术进一步鉴定。通过NaOH-甲醇法进行全细胞脂肪酸甲酯化处理菌株样品，GC-MS进行检测，确定谱峰，进而利用百分面积归一化法计算相对峰面积对气相色谱图中多个谱峰进行聚类分析，将所分离得到的44个菌株分为三类，结合前期传统形态学鉴定情况并根据国际微生物命名原则给予相应命名：北-11022与七-91018为一类(d=25)，此类命名为Septoriamicrospora(speg)var.wxj.；北-51022与七-31022为一类(d=7)，此类命名为Septoriamicrospora(speg)var.wsf.；其他40株为一类(d≤4)，即为Septoriamicrosporaspeg.。然后，基于重复序列，设计了20条引物AW40694-AW40713对四个产地44个菌株的DNA模板进行重复序列间区(ISSR)PCR扩增，从中筛选出6条在44个菌株中扩增共得到36条带。为此进行了CTAB法的改进，提取出较高质量的龙胆斑枯病原菌DNA模板；建立了适合龙胆斑枯病原菌的ISSR反应体系：20μl的PCR反应体系中含模板DNA1.0μl、ISSR引物2.0μl、Mg2+1.2μl、dNTP0.4μl、Taq酶0.5μl、Buffer2.0μl、H2O12.2ul。ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min,94℃变性30sec,50℃退火复性45sec,72℃延伸2min，共计40个循环，循环结束后72℃延伸6min。利用PopGen32软件分析获得遗传距离和遗传相似度，MEGA2软件构建了龙胆草斑枯病菌的遗传距离聚类图UPGMA；聚类分析结果显示，在0.26水平上将以上龙胆斑枯病原菌株分为3类：北-51022、北-41022、莲-31207、七-31022、七-71022、莲-11022、七-21207、北-31105、校-101106它们九个聚为一类；北-11022、七-91018、莲-21022、北-101001、莲-21106、七-101022、七-51001、莲-71106、莲-61207、七-41105这十个聚为一类；其他25个与标准菌株聚为一类。可见，ISSR分子遗传标记所聚类的差异个体明显多于GC-MS气质联用色谱法中聚类分出的差异个体；但气相色谱法差异个体相应分类的趋势与DNA分子遗传标记分类趋势基本一致。利用ISSR分子生物学标记技术再次对分离纯化得到的44个菌株进行鉴定分类，是进一步佐定了龙胆斑枯病病原菌的变种情况。最后，三种方法的结果综合来看，得出最终结论：北-51022与七-31022这两株、北-11022与七-91018这两株，分别各为一类，但都是在SeptoriamicrosporaSpeg.这个种下又分出两个变种或称亚种；根据国际微生物命名法则：北-11022这类命名为Septoriamicrospora(speg)var.wxj.；北-51022这类命名为Septoriamicrospora(speg)var.wsf.。

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作者
汪胜福;
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作者单位

黑龙江中医药大学;

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授予单位黑龙江中医药大学;
学科生药学
授予学位硕士
导师姓名王喜军;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类草本作物病虫害;微生物鉴定;
关键词
药用植物病害; 龙胆草斑枯病; 病原菌; 形态学; 气质联用色谱; 分离纯化;

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