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甲型H1N1流感病毒(2009)HA蛋白的原核表达及酶免检测研究

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2009年春季,一种新型甲型H1N1流感病毒,在短时间内迅速蔓延至全球,给人类的生命健康造成了极大的威胁,给各国带来了巨大的经济损失。本研究立项之初,国内外暂无针对此次甲型H1N1流感(2009)的商品化试剂盒,人群对此新型流感病毒普遍易感。因此,建立一种方便、快捷、灵敏的检测方法对于尽早地作出诊断和治疗、防止疫情的大流行具有重大意义。
　　 根据病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,流感病毒可以分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶的不同,又可以分为各种亚型。甲型流感病毒的8个基因节段共编码11种蛋白,其中第4节段RNA编码的HA蛋白是病毒表面最主要的糖蛋白,具有较强的免疫原性,可以激发体液免疫和细胞免疫,诱导机体产生针对流感病毒的中和抗体,是决定病毒毒力的主要因素。为了给甲型H1N1流感(2009)的及早诊断和防治提供依据,本论文选择HA蛋白作为研究对象,采用原核表达系统表达目的蛋白,将由其免疫获得的单抗用于甲型H1N1流感病毒(2009)酶免检测方法的探索。主要的研究内容由两部分组成:
　　 1.HA抗原的表达:根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒(2009)血凝素基因序列,人工合成HA基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,0.1mM IPTG条件下诱导表达。重组蛋白采用镍离子亲和层析法进行纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot检测。结果表明,HA基因获得表达,产物以包涵体形式存在,相对分子量约62kD,具有较好的免疫反应性。
　　 2.甲型H1N1流感(2009)双抗体夹心检测方法的初步建立:以基因工程表达的HA重组蛋白作免疫原制备单抗,选择其中的两株配对单抗建立甲型H1N1流感病毒(2009)HA抗原双抗体夹心ELISA法,并对该方法的特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行评估。结果表明,该方法能特异性地检出甲型H1N1流感病毒(2009),而与H1N2、H3N2、H5N1和乙型流感病毒无交叉反应;对HA抗原的最低检出限达到1ng/mL,且具有较好的精密性和稳定性。

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