抑制葡萄糖脑苷脂酶降低组织蛋白酶D引起小鼠帕金森病的机制研究

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研究背景帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常见的神经系统退行性疾病，PD的病理特征为中脑黑质内多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元丢失、路易小体（Lewy bodies，LB）出现以及LB内α-突触核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）的病理性沉积，沉积的α-syn对神经元有毒性作用。发生PD危险因素有很多，近年来，有研究指出葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase，GCase; GBA）含量下降是发生 PD的危险因素之一。GCase是一种可溶性的糖酯类物质，广泛存在于细胞溶酶体内，主要参与鞘脂代谢，由 GBA 基因表达形成。当 GBA突变时，GCase的表达含量及活性下降。研究发现在散发性 PD患者脑内黑质中，GCase的含量及活性均下降。有动物模型发现抑制 GCase 表达时，黑质内 α-syn 沉积增多，可以出现 PD 症状。中枢神经系统细胞内主要靠两大途径维持蛋白质的稳态，分别是自噬-溶酶体途径（autophagy lysosome pathway，ALP）和泛素-蛋白酶体系统，其中ALP是降解α-syn的主要途径。组织蛋白酶D（Cathepsin D，CTSD）是溶酶体内的一种水解酶，在水解蛋白沉积物时发挥重要作用，CTSD的含量可以反映溶酶体的功能。α-s yn经过磷酸化、硝基化的修饰，形成有毒性的不可溶的蛋白聚集体，沉积在细胞突触前膜。研究证实丝氨酸129 (serine129，S129) 磷酸化 α-syn参与 α-syn的转运和病理性积聚，在 PD的病理过程中特异性较α-syn高。目的本研究使用 8w的雄性 C57BL/6小鼠。抑制 GCase水平后，观察小鼠运动情况、黑质内DA神经元数目变化情况以及S129磷酸化α-syn、CTSD、GCase蛋白水平的变化情况。材料与方法本研究选用体重 20-25g、8周的雄性 C57BL/6小鼠。将小鼠分成 3组（每组 30 只），分别是：对照（Control）组、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）组和神经酰胺β-环氧化物（conduritol β-epoxide，CBE）组。MPTP组腹腔注射MPTP（30mg/kg），连续5天，每天上午 9点注射，建造亚急性 PD模型。Control组腹腔注射相等体积的生理盐水。CBE组腹腔注射 CBE（200mg/kg），连续注射 2天，每天上午 9点注射。用爬杆试验观察小鼠运动情况。分别计数小鼠在顶端准备向下爬行的时间（time to orient downwards，t-turn）和小鼠从准备向下爬行至木杆底部的时间（time to descend the pole，t-descend），t-turn反映小鼠运动协调性，t-descend反映小鼠是否出现运动迟缓。利用Western blotting技术观察小鼠黑质内S129磷酸化 α-syn、CTSD及 GBA的表达变化。为了解小鼠黑质内 DA神经元的变化情况，运用免疫组化观察小鼠神经元内酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）免疫阳性细胞数目的变化。采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行单因素方差分析，比较用药前后的变化情况，P<0.05为差异有统计学意义。结果 1．与 Control组相比，腹腔注射 MPTP、CBE后小鼠出现竖毛、竖尾、静止性震颤、运动迟缓、姿态平衡障碍的症状。爬杆试验结果显示，t-turn 和 t-descend的时间延长（P<0.001）。 2．免疫组化结果显示：与对照组相比，MPTP 组和 CBE 组双侧黑质内的TH免疫阳性细胞数目显著减少（P< 0.001）。 3．Western blotting结果显示：与对照组相比，MPTP组和CBE组均出现S129磷酸化α-syn表达增多（P< 0.01,P< 0.05），CTSD、GBA表达降低（P< 0.001）。结论 1．溶酶体水解功能下降是黑质区S129磷酸化α-syn沉积的原因。 2．GCase的水平降低是发生PD的危险因素之一。 3．抑制GCase蛋白水平时，通过降低CTSD的含量引起黑质区S129磷酸化α-syn聚集和DA神经元丢失，导致小鼠出现PD症状。

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作者
孙政;
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作者单位

郑州大学;

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授予单位郑州大学;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名马建军;
年度 2018
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类内分泌腺疾病及代谢病;病理学;
关键词
抑制; 葡萄糖脑苷脂酶; 组织蛋白酶; 小鼠帕金森病;

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