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慢病毒介导的肺特异性X蛋白(LUNX)siRNA转染表达对A549肺癌株抑制作用的研究

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摘要

引言

第一部分 LUNX mRNA质粒构建、构建慢病毒LUNX siRNA载体、转染A549肺癌细胞株和转染鉴定

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二部分 慢病毒介导的RNA干扰对A549肺癌细胞株生物功能学影响及其机制的研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

综述一 小结节肺癌的外科治疗进展—根治性亚肺叶切除术

综述二 应用于肺癌早期检测、诊断及预后的生物标记物和分子检验

中英文缩略语

攻读研究生期间发表的主要成绩

致谢

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摘要

作为一名肺肿瘤外科医生，必须掌握生物肿瘤标志物和分子、基因组学的基础知识，这样才能把握肺癌研究领域的最新进展。肺癌的分子生物学特征呈现出高度的复杂性和变化的异质性，在生物学、遗传学、基因学、蛋白基因组学等多个学科层面上的分子机制和功能变化还尚未明确，外科医生在这些方面的深入理解，非常有助于进一步研究肺癌的诊断方法、治疗手段和预后检测。
　　肺癌的发病机制是一个多时间点、多变化性的进展过程，可以认为肺癌仍然是一种由诸多个性化基因或者基因组驱动的疾病，并非单一基因突变能够导致，其中包括多种多样的基因功能异常。大多数学者已经达成共识，促癌基因和抑癌基因的改变共同贯穿了肺癌的整个进展过程，特别是促癌基因相关通路的激活和抑癌基因相关通路的失活。对这些信号通路的研究，包括肺癌发生发展的分子机制的研究，对于治疗策略的进展至关重要。使用这些信息来指导治疗的基础是治疗基因的特异性改变。例如靶向基因调控异常的分子信号及其激活的下游通路。近年来，依据新型靶向药物以及新的肿瘤生物标记物来指导临床治疗，促使肿瘤生长的特定基因改变及其提供的治疗靶点在肺癌的治疗中已经出现了显著的临床效果，仍然需要进一步探索新的治疗靶点及其相应药物。
　　肺癌是全世界范围内患病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，每年总计约有七百万人死于肺癌及肺癌相关并发症。随着工业化污染和大气污染的加剧，肺癌已经成为中国居民中患病率和病死率上升最快的恶性肿瘤，已经占据男性肿瘤患者死亡原因的第一位，女性肿瘤患者死亡原因的第二位，每年病死人数在六十万以上，肺癌总体病死人数占到了总体肿瘤死亡人数的22.7％。
　　从肺外科医生的角度来看，手术治疗是治疗肺癌的最佳治疗手段，随着医疗技术的不断发展，越来越多的肺小结节病灶被发现，肺段切除术、亚肺叶切除术、肺叶切除术治疗肺结节开展的越来越广泛，术后病理证实，其中大部分结节为恶性，而且早期非小细胞肺癌占大多数。但是中国大多数肺癌患者初次就诊已经进入中晚期，失去手术时机，即使是没有淋巴结转移的IA、IB期患者，在接受根治性切除手术后5年内，复发率仍然高达30％以上。研究表明，肺癌患者大部分存在隐匿性微转移病灶，只是现有的彩超、CT、MRI，甚至PET-CT等常规临床检查手段无法早期发现。
　　肺癌的诊疗模式已经进入多学科协作(MDT)模式和精准治疗时代，早期发现、早期诊断、早期治疗、疗效预测、改善预后，是新时代肺癌治疗领域的最主流方向。目前肺癌的早期微转移检查方法集中在血液肿瘤标志物检测方向，但是尚有许多不足之处，同时，液体活检技术快速发展，包括血液循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体的检测，这是蛋白质组学、基因组学进展的临床医学转化，也是肺癌进入基因治疗时代的必然趋势。肿瘤细胞分泌的外泌体越来越引起重视，这种物质包含是一种包含肿瘤基因miRNA及其蛋白产物，通过与肿瘤微环境中的其他细胞相互作用，在肿瘤进展、远处转移和免疫逃逸等方面有重要意义。
　　日本肿瘤科医生Kyoko Iwao Koizumi通过蛋白差异显示技术，分离出一种在人类呼吸系统脏器内特有表达的蛋白一肺特异性X蛋白mRNA(LUNX mRNA)，近年来的研究发现，LUNX mRNA在肺癌组织、癌转移淋巴结、前哨淋巴结、跳跃性转移淋巴结、肺癌转移灶中均存在高表达，因此，证明LUNX mRNA在肺癌发生、发展、转移过程中有重要作用，LUNX mRNA检测是一种早期发现肺癌亚临床微转移的有效手段，LUNX mRNA也是肺癌临床基因治疗的一个潜在靶点。
　　Small interfering RNA(siRNA):是一种小RNA分子（21-25核苷酸），长度约在22nt左右，由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成，所以具有Dicer产物的特点。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。siRNA通过干扰细胞内正在转录的mRNA，从而抑制个别基因的表达，进一步阻止其蛋白合成。Dicer酶将一个由能自我复制的基因序列，又称miRNA的调控序列生成的长片段，切割成短siRNA。siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。进入细胞内的途径是转染表达，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA产生完全互补作用。siRNA的功能是导致靶标基因的降解，是RNA干扰作用的产物，siRNA的原始作用是抑制转座子活性，在某些病毒感染人体时，能抑制病毒感染，是人体自我保护机制。然而，siRNA的设计需要仔细比对靶基因的生物信息学分析。靶标一般在CDS区选择:siRNA的作用是在mRNA水平，而不是在蛋白质水平。设计siRNA之前，需要进行Gene Bank库准确检索靶mRNA的序列。某些情况下，会出现siRNA的无效设计，所以不是根据基因组序列，而是根据mRNA序列而来设计。
　　RNA干扰技术(RNA interference，RNA i)是通过小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)造成目的mRNA特异性降解，从而使基因转录后沉默的一种现象。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。通过几种蛋白的活性，通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。这一现象广泛存在于自然界生命体中，是一种在生物进化过程中，能够有效抵御外来基因改变原有基因结构作用的机制，为保持生物基因组稳定发挥着重要作用。RNA i可以作为一种高效的基因剔除工具，广泛应用于功能基因组学研究领域，并将逐渐进入肺癌临床基因治疗时代。
　　慢病毒属于反转录病毒，作为一种载体，慢病毒表达质粒可以转导、整合目标基因mRNA至受体染色体组DNA，并进一步达到持久性表达，慢病毒介导的RNA干扰技术安全、高效，可以达到良好的基因干扰与基因沉默效果。本次试验研究，通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术，以LUNX蛋白表达阳性的A549肺癌细胞（腺癌）株为研究对象，以LUNX mRNA为目的靶基因，转染表达LUNX siRNA进入肺癌细胞，并通过免疫组织化学法、Real-time PCR(RT-PCR)技术、噻唑蓝(MTT)比色法、免疫酶化学法、划痕实验法、透射电镜观察等技术，研究LUNX mRNA的降低表达对细胞生物学行为的影响。此外通过检测A549肺癌细胞株的碱性磷酸酶(AKP)、表面活性蛋白(SPC)和溴化脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)的表达变化，进一步分析LUNX mRNA调控A549肺癌细胞生物学功能的信号通路和分子机制。本研究旨在通过以上实验探讨LUNXmRNA在肺癌早期微转移中的作用及其机理，筛选LUNX作为新的肺癌治疗靶点，检验其作为靶向基因治疗的可能性、为肺癌的精准治疗研究、新型基因治疗药物的发现提供必要的实验室证据。
　　目的:
　　1.1 根据LUNX编码区基因序列，设计并合成LUNX siRNA的DNA，以慢病毒(pGCL和pHelper1.0)为载体，构建并进行细胞转染。
　　1.2 研究LUNX转染表达对A549肺癌细胞株的细胞形态、增殖、凋亡和转移等生物学功能的影响。
　　方法:
　　2.1 应用慢病毒基因转染表达方法检测LUNX表达对A549肺癌细胞株的抗增殖作用和生物学功能的影响。
　　2.2 MTT实验和细胞划痕实验观察A549肺癌细胞增殖和迁移能力变化。
　　2.3 RT-PCR技术检测A549肺癌细胞株中LUNX-siRNA的表达。
　　2.4 通过免疫组织化学法和RT-PCR技术检测LUNX-siRNA在A549肺癌细胞株中的表达水平。
　　结果:
　　3.1 利用LUNX基因确定其序列特异性，设计并合成LUNX-siRNA的DNA，退火、酶切、连接载体后进入pGCL-GFP表达质粒。混合pHelper1.0和pGCL-GFP载体，成功构建LUNX-siRNA慢病毒载体。
　　3.2 将体外培养好的A549肺癌细胞株分为3组:A组:LUNX-siRNA和pGCL-GFP共转染组，B组:未转染组，C组:pGCL和pHelper1.0共转染组，A组为实验组，B，C两组为对照组。成功进行了转染后，加入400μgPmIG419筛选，经3周后形成阳性克隆组，扩增培养。
　　3.3 LUNX转染的A549细胞株迁移能力低于正常A549细胞株(P=0.026)。
　　3.4 免疫细胞化学证实转染后A549肺癌细胞中有LUNX稳定表达。
　　结论:
　　4.1 成功构建带有靶向基因特异性小干扰RNA的慢病毒，将其感染肺癌细胞后，可有效降低目标蛋白-肺特异性Ⅹ蛋白的表达。
　　4.2 体外制备的LUNX-siRNA对肺癌A549细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用。
　　4.3 LUNX mRNA的低表达导致其下游部分蛋白分子的表达降低，可能机制是通过负性调控信号通路降低了AKP、SPC和BrdUrd的表达。
　　4.4 LUNX作为肺癌精准治疗、靶向基因治疗的新靶点是具有一定可行性的。

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