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用于膀胱过度活动症治疗的天然草药活性成分尼古丁靶点研究

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引言

第一部分：索利那新尼古丁受体作用研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

小结

附图

附表

第二部分：苦碟子抗尼古丁活性成分的提取分离

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

小结

附图

第三部分：苦碟子抗尼古丁单体化合物结构鉴定

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

综述: 新型抗胆碱能药物治疗膀胱过度活动症的Ⅱ期临床研究进展

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摘要

背景和目的：
　　膀胱多度活动症（overactive bladder，OAB），是临床上常见以尿急症状为特征的症候群，常伴尿频、夜尿，可伴或不伴急迫性尿失禁。正常排尿需要神经系统、膀胱和括约肌机制的协调。OAB致病机制的包括中枢神经系统、外周神经系统等不同水平及膀胱平滑肌本身的抑制失控和异常兴奋。有研究显示，全世界约有10.7％的人（4.55亿）患有OAB，欧美国家的调查发现，OAB的发病率随着年龄的增长而急剧增加，40-44岁年龄组男性病率为3%，女性为9%，75以上岁年龄组的男性发病率为42%，女性为31%。可以说，OAB是一常见的功能障碍，虽然并不致命但在世界范围内严重影响了患者的生活质量，包括生理、心理、社会及性生活方面的问题，此外，还使患者承受较大的经济负担。
　　药物治疗是OAB治疗的基础，抗胆碱能药物是目前临床治疗OAB的一线药物，该类药物通过选择性阻滞介导膀胱逼尿肌收缩的乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）与乙酰胆碱受体结合，抑制逼尿肌不自主收缩，改善膀胱功能。乙酰胆碱受体包括两类，毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarinicacetylcholine receptors，M受体）和烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors. N受体）。无论是M受体还是 N受体在氨基酸组合及结构上都有一些共同特征。目前有研究证实，经典M受体阻滞剂阿托品、毒扁豆碱亦可作用于N受体。同时，N受体表达于尿道上皮与膀胱传入神经中，参与了逼尿肌的收缩作用，与OAB的发生相关，因此，N受体阻滞剂因此也成为了治疗OAB的潜在药物。研发人员将N受体阻滞剂左旋美加明氢氯化合物Dexmecamylamine应用于OAB的治疗，近期完成了Dexmecamylamine的Ⅱ期临床试验。另一方面，索利那新作为一种临床上目前常用的治疗OAB新型抗胆碱药，具备 M3受体高度选择性的特性，目前在临床观察中证明，索利那新在治疗OAB的过程中未发现认知功能损害及心血管不良反应，临床耐受性良好。同时有报道称已发生对托特罗定（tolterodine）不敏感的OAB患者，改服用索利那新取得满意的疗效。是否存在索利那新类似阿托品，通过阻滞N受体治疗OAB的可能？为此，本课题组拟以基因工程获得的具有表达多种N受体作为蛋白质靶标分子的非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus Oocytes）模型，在分子水平上对索利那新进行靶向测定，分析确定其对N受体的作用。
　　中药、植物药是医药的重要组成部分，其活性物质的分离和提纯是药物先导化合物和新药开发的重要途径，如紫杉醇、青蒿素、麻黄碱等药物就是来源于天然产物。本实验拟通过利用小白鼠进行生物活性跟踪，结合天然产物的色谱分离和结构鉴定，生物靶点作用研究，以期发现新颖的、作用于 N受体的天然有机小分子化合物。这类化合物的发现为研发用于治疗OAB的新药起了一个重要的开端。
　　菊科(Copositae)苦荬菜属(Ixeris genus)植物抱茎苦荬菜（Ixeris sonchifolia hance）,别名为苦碟子，属多年生草本植物，中医认为其具有解热、镇痛、消炎等作用。药理研究表明，苦碟子可能具备保肝、抗氧化、抗烟碱、抗病毒等作用。苦碟子全草为原料制成的中药注射液“碟脉灵注射液”，目前在临床上用于治疗心血管疾病药物。分离提取苦碟子的有效成分及对这些成分进行药理活性研究是目前研究热点，主要分离成分包括腺苷、倍半萜内酯类和黄酮类化合物。本实验利用色谱柱法分离苦碟子有效成分，通MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC和DEPT等方法对分离出的2个化合物单体结构进行鉴定。来探索苦碟子中具有抗尼古丁活性成分的情况，期望获得治疗OAB的抗胆碱能药物的先导化合物。
　　第一部分：索利那新尼古丁受体作用研究
　　材料和方法
　　1.选择至少半年未取过卵母细胞的雌性成年爪蟾，手术取出成熟的爪蟾卵母细胞，移入含有庆大霉素的巴士缓冲液。
　　2.琥珀酸索利那新片ND96溶液溶解，抽滤，稀释制成摩尔浓度为1mM的索利那新标准液备用。
　　3.使用质粒中量提取试剂盒分别提取含有α3、β4、α4、β2和α7亚基的质粒，用限制性内切酶进行酶切，使用RNA转录试剂盒对酶切后的线性DNA进行转录，使用转录清洁试剂盒分别对cRNA进行纯化，最后测定OD值。
　　4.使用显微注射器对爪蟾细胞进行注射，每个爪蟾细胞注入13-50 nL水溶液、10-40 nG cRNA。
　　5.使用自动并联电压钳电生理记录系统记录N受体爪蟾细胞表达模型的乙酰胆碱门控作用电流。
　　6.实验数据分析和制表软件采用Prism5 Graphpad，拟合剂量反应方程I=Imax/[1+(X/IC50)nH],其中，I为受体激动剂（乙酰胆碱）浓度（X）的电流响应，Imax为最大电流，IC50为实验药物（索利那新）的半效抑制浓度，nH为希尔系数。经过计算可得索利那新的半效抑制浓度及量效关系曲线。
　　结果
　　1.在N受体亚基（α4β2,α3β4和α7）爪蟾卵母细胞模型上，索利那新可有效阻滞乙酰胆碱引起的内向电流，给予100μM索利那新可使内向电流减少80%~95%，其中α3β4亚基内向电流减少尤其明显。在冲洗3分钟后，再次给予乙酰胆碱，内向电流可恢复，为可逆性抑制作用。
　　2.索利那新可高度选择性竞争抑制乙酰胆碱与α3β4受体相结合，其 IC50值为409±51 nM，而α4β2与α7受体上索利那新的IC50值分别为5.5±1.1μM、8.4±1.0μM，分别是其的13倍与20倍。
　　第二部分：苦碟子抗尼古丁活性成分的提取分离
　　材料和方法
　　1.取干燥的苦碟子粉末22千克，95%的工业乙醇浸泡，乙醇提取液共浓缩成6L水液浓缩物，依次使用石油醚（petroleum ether，PE）、乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）和正丁醇（n butanol）进行萃取，得石油醚萃取物303克，乙酸乙酯萃取物49克和正丁醇萃取物131克。
　　2.将303克的石油醚（PE）萃取物用适量的乙酸乙酯溶解，称取400g硅胶（200-300目）倒入研钵内，然后将溶解好的PE层萃取物倒入研钵内并与硅胶拌匀，在通风橱中挥发溶剂至干，将拌过硅胶的样品研磨均匀，作为上柱样品。经TLC检测后选择石油醚-乙酸乙酯体系为合适的洗脱剂，石油醚作为溶剂湿法装柱。称取1500g硅胶作为柱层析硅胶，用石油醚拌为糊状，玻璃棒搅拌赶出气泡，然后倒入内径为17cm的玻璃柱中，湿法装柱，冲实后上样，依次用PE：EA混合洗脱剂20:1、15:1、10:1、4:1、2:1、1:1、乙酸乙酯、甲醇梯度洗脱，用250ml锥形瓶收集馏分，TLC法检测追踪成分，1%香草醛浓硫酸的乙醇溶液为显影剂，110℃下加热显色，以硅板上斑点颜色位置来跟踪检测，合并相同斑点的收集馏分。共得到10个成分，A1~A10。
　　3.将49g乙酸乙酯（EA）萃取物用适量的乙醇溶解，装柱方法与石油醚萃取物装柱方法相同。称取200g硅胶拌样晒干，称取硅胶1000g，用二氯甲烷调成糊状，倒入内径为13cm的玻璃柱中，湿法装柱，冲实后上样，依次用二氯甲醇，二氯甲醇：甲醇混合洗脱剂40:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、2:1，甲醇梯度洗脱。共得到8个成分，F1~F8。
　　结果
　　1.本实验先后给予小白鼠苦碟子分离成分及尼古丁溶液灌胃，先给予样品去离子水溶液灌胃，20分钟给予致死剂量的尼古丁溶液灌胃，观察小白鼠的抖动、瘫痪、死亡等尼古丁毒性情况，如小白鼠未表现出尼古丁中毒症状，则推测所给予的苦碟子成分可能具备抗尼古丁活性。
　　2.通过有机溶剂萃取、柱层析及高压液相色谱等分离方法，利用薄层色谱法鉴别、跟踪分离成分，从苦碟子全草分离得到抗尼古丁活性成分，特别是乙酸乙酯萃取物中的F2-4-2具有显著的抗尼古丁活性。对F2-4-2进一步利用高压液相色谱分离的得到2个单体化合物F2-4-2a和F2-4-2b，有望成为新型治疗OAB药物的先导化合物。
　　第三部分：苦碟子抗尼古丁单体化合物结构鉴定
　　材料和方法
　　1.样品（F2-4-2a和F2-4-2b）经HPLC分离后，减压旋蒸掉流动相溶剂，分别用氘代氯仿溶解，进行核磁测定。
　　2.通过MS（质谱）、1H-NMR（核磁共振氢谱）、13C-NMR（核磁共振碳谱）、HSQC（异核单量子关系谱图）和DEPT（无畸变极化转移增强谱图）等方法对分离得到的F2-4-2a、F2-4-2b2个单体化合物进行结构鉴定。
　　结果
　　1.得到2个可能具备抗尼古丁活性的新型单体化合物，分别为 F2-4-2a为(R)-(–)-5-Hydroxy-4-(2-hydroxy-propylidene)-5,6,6-trimethyl-cyclohept-2-enone，右旋5-羟基-4-(2-羟基-亚丙基）-5,6,6-三甲基-2-烯环庚酮；F2-4-2b为(L)-(+)-5-Hydroxy-4-(2-hydroxy-propylidene)-5,6,6-trimethyl-cyclohept-2-enone，左旋5-羟基-4-(2-羟基-亚丙基）-5,6,6-三甲基-2-烯环庚酮
　　2.2个化合物为首次发现，其抗尼古丁活性可能与拮抗尼古丁与烟碱受体结合有关，但具体机制仍需进一步研究，期望获得治疗OAB的抗胆碱能药物的先导化合物。

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