人源抗-抗GBM抗体单链抗体scFv3原核载体的构建、表达和纯化

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　　抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)疾病是一种罕见的自身免疫性疾病，特点是急进性肾小球肾炎和肺出血。虽然本病的发病率低，但多数患者病情重，预后差，死亡率高。介导本病的关键因素是抗GBM抗体。抗体与靶抗原结合后诱发免疫损伤，导致补体系统的活化，白细胞的侵润和蛋白尿的产生。因此，抗GBM抗体对于本病的发生发展有重要意义。
　　随着对肾小球基底膜病发病机制的深入研究，发现抗GBM抗体的主要靶抗原位于肾小球基底膜Ⅳ型胶原α3链的非胶原区1中[α3(Ⅳ)NCl]。在正常情况下，抗原表位(EA和EB)处于隐蔽位置。当感染、吸烟和接触有机溶剂时，抗原表位暴露，诱发自身免疫反应，产生抗GBM抗体。动物实验和临床观察已证明，抗肾小球基底膜抗体具有致病性。1967年，Lerner等人在Goodpasture综合征患者血清和肾脏中发现了抗GBM抗体，证明将此种抗体注入猴子体内可导致肾炎，从而证实了抗GBM抗体的存在及其致病作用，明确了Goodpasture综合征的发病与抗GBM抗体有关。近来研究发现抗GBM抗体的亚型、亲和力和滴度与病情的严重程度和预后有明显相关。正常人体内也能检测出抗GBM抗体，但其滴度和亲和力都显著低于患者且亚型不同，提示抗体的特性变化与发病有重要的关系。目前抗GBM病的主要治疗方法是强化血浆置换和免疫抑制联合。血浆置换的目的是清除循环中的抗GBM抗体，而免疫抑制剂使新的抗体形成减少。国外报道，早期应用强化血浆置换合并糖皮质激素和环磷酰胺治疗，85％的患者能够存活，40％进入终末期肾脏病ESRD(end-stage renaldisease)。而早期未诊断治疗的患者死亡率可达89％。因此，积极清除和抑制抗体的产生是治疗和改善预后的关键。如果能获得针对抗GBM抗体的特异性抗体，使这种特异性抗体与抗GBM抗体结合，抑制和阻断抗GBM抗体与基底膜靶抗原的结合，那么就可以延缓和阻止疾病的发生。
　　目前，噬菌体展示技术已成为抗体工程的一项重要技术，它将大量的多肽和蛋白展示在噬菌体表面，建成噬菌体抗体库，通过亲和筛选直接从抗体库中筛选出特异性强、亲和力高的噬菌体抗体。由于噬菌体抗体容易经过改建在大肠杆菌或酵母菌中大规模生产。因此，噬菌体抗体表现出了巨大的潜能和广阔的应用前景。
　　本实验所用的单链抗体scFv3基因是在北京大学通过噬菌体展示技术筛选所得。我们通过基因工程重组技术和亲和层析技术，得到了纯化的单链抗体scFv3，经间接ELISA试验鉴定了这种单链抗体与抗GBM抗体的免疫反应性。为获得大量高纯度的单链抗体scFv3，以便进一步分析其特性和大规模生产，我们将抗体scFv3基因亚克隆入表达载体PET系统，在大肠杆菌中进行高效表达纯化。
　　材料与方法：
　　本实验以噬菌体展示技术所筛选的单链抗体scFv3基因为模板，XP1和XP2为引物，进行PCR扩增。将目的基因回收后克隆入pGEM-T Easy载体，转入大肠杆菌Top10，通过蓝白筛选，选出阳性克隆。经PCR和酶切鉴定证实克隆载体pGEM-scFv3构成。提取质粒DNA，用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ.双酶切，再将目的DNA片段亚克隆入原核表达载体pET28a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)。选出阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。鉴定之后，将重组菌用IPTG30℃诱导表达20小时，SDS-PAGE电泳分析。通过HisLink Spin蛋白纯化系统，获得纯化的单链抗体scFv3。最后，纯化的抗体蛋白经间接ELISA法初步检测其免疫反应性。
　　结果：
　　 1、扩增的基因片段约750bp，与筛选所得的scFv3基因大小相符。
　　 2、PCR和酶切鉴定证实scFv3基因已插入pGEM-T Easy载体，克隆载体pGEM-scFv3构建成功。
　　 3、PCR和酶切证实scFv3基因已亚克隆入表达载体pET28a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)。测序验证克隆入表达载体的基因序列与筛选所得的单链抗体scFv3基因序列相同。
　　 4、SDS-PAGE电泳显示重组菌诱导表达出一条明显的蛋白条带，分子量在27kD左右。
　　 5、通过亲和层析技术，获得了纯化的scFv3蛋白。
　　 6、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)初步证实纯化的单链抗体scFv3与抗GBM抗体有免疫反应性。
　　结论：
　　 1、成功构建了克隆载体pGEM-scFv3。
　　 2、成功构建了表达载体pET28a-scFv3。
　　 3、单链抗体scFv3分子量为27kD，可通过亲和层析技术纯化。
　　 4、纯化的单链抗体能与抗GBM抗体结合，具有较好的免疫反应性。

著录项

作者
王雅楠;
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作者单位

郑州大学;

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授予单位郑州大学;
学科肾脏病学
授予学位硕士
导师姓名邢国兰;
年度 2010
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肾小管、肾小球疾病;
关键词
人源抗; 单链抗体; 原核载体; 基因; 噬菌体展示技术; 噬菌体抗体; 免疫反应性; 克隆载体; 大肠杆菌; 表达载体; 纯化; 抗肾小球基底膜; 筛选; 血浆置换; 蛋白; 层析技术; 特异性抗体; 酶切; 鉴定; 间接酶联免疫吸附试验;

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