河南食管癌高发区食管/贲门双源癌患者蛋白质组和比较基因组杂交研究

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食管癌(Esophageal cancer，EC)是最常见的六大恶性肿瘤之一，河南林州地区是世界上食管癌发病率最高的地区，组织类型以食管鳞癌(Esophagealsquamous cell carcinoma，SCC)为主(95％)。该地区贲门腺癌(Gastric cardiaadenocarcinoma，GCA)发病率也很高。目前，SCC和GCA仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因。该地区的另一特殊现象是同一个体同时发生食管鳞癌和贲门腺癌，我们称之为食管质门双源癌(Primary concurrent cancers of the esophagusand gastnic cardia from the same patient，CC)。食管/贲门双源癌并不少见，但由于食管/贲门双源癌漏诊率很高(90％)，其发生率的报道差异很大(0.4-2.5％)。我们实验室对林州地区14805例单发食管癌和贲门癌患者进行回顾调查，发现双源癌占本组病例的7％。发生于同一个体的食管/贲门双源癌处于相同的机体内环境，接触相同的外界环境因素，遗传背景相似，因此，对比分析食管/贲门双源癌组织分子变化特征，不仅有助于加深对食管鳞癌和贲门腺癌分子差异的认识，对阐明食管/贲门癌变机理，进一步筛选和鉴定用于高危人群预警和早期发现的分子指标和手段提供重要的理论依据和信息。但是，因食管/贲门双源癌漏诊率高，资料收集比较困难，目前国内外有关食管/贲门双源癌的研究报道甚少，多数资料为临床个案报道，有关分子机理的研究报道更少。本实验室检测河南林州地区食管/贲门双源癌组织中11种蛋白表达(P53，Rb，P16，mdm2，C-erb2，bax，MUC1，PCNA，CyclinD1，bcl-2，P21waf1)，发现MUC1，bcl-2和P53在食管癌和贲门癌组织中一致性表达率最高。然而，单纯分析这些蛋白质变化特征，很难全面反映食管/贲门双源癌组织细胞内全部蛋白质的表达状况，从而难以确定食管/贲门双源癌癌变关键蛋白。近年研究提示，蛋白质组研究是检测细胞恶变相关差异表达蛋白，阐明癌变机理的有效手段之一，特别是表面增强激光解析离子化-飞行时间-质谱(surfaceenhanced laser desorption inionation-time of flight-mass spectra，SELDI-TOF-MS)蛋白质组学技术，具有高通量和高灵敏度等特点，特别适合肿瘤标志物的筛查研究。但是，由于SELDI-TOF-MS技术主要检测患者血清差异蛋白，这些差异蛋白不能完全反映肿瘤组织中蛋白和基因的改变，而肿瘤组织比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)是一种将原位荧光杂交技术与数字图像分析相结合，检测肿瘤组织DNA全基因组异常(缺失、扩增、复制)，并在染色体上定位这些变化的基因。很显然，在分析患者血清蛋白质组变化的基础上，结合组织CGH分析，将能更全面了解食管/贲门双源癌患者特异蛋白和基因改变，因此本研究采用SELDI-TOF-MS技术与CGH技术，从蛋白和基因水平探讨食管/贲门双源癌的血清和组织分子变化特征和规律，并与单发食管癌和单发贲门癌分子改变进行比较，筛选和确定食管/贲门双源癌相关侯选蛋白和基因，加深对其癌变分子机制的了解，并为进一步筛选和建立用于高危人群预警和早期发现的分子指标和手段提供重要的理论基础和信息。 2．材料与方法 2．1．研究对象 2食管/贲门双源癌患者(双源癌组)：共19例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院(男15例，平均年龄62±11岁；女4例，平均年龄71±11岁)。病理检查证实为原发食管鳞癌和贲门腺癌。单发食管癌患者(食管癌组)：共61例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院(男36例，平均年龄59±79岁；女25例，平均年龄56±9岁)。病理检查证实均为食管鳞癌，T分期：T1：7例，T2：8例，T3：44例，T4：2例；合并淋巴结转移25例。单发贲门癌患者(贲门癌组)：共47例，来自河南省林州市食管癌医院及林州市中心医院(男36例，平均年龄61±8岁；女11例，平均年龄61±10岁)。病理检查证实为贲门腺癌，合并淋巴结转移23例。健康对照组：共50例，来自食管癌高发区无症状普查居民(男29例，平均年龄56±11岁；女21例，平均年龄60±10岁)。均经胃镜检查和活检病理证实为无食管炎等食管良性疾病。 2．2样本(血清、组织)的收集 2．2．1血清：所有检测对象均取5ml空腹静脉血，将血清与血凝块分装，-8000冰箱保存。特别指出，取血样前，每例检查对象均排除急慢性炎症(肝炎，等)等疾病。 2．2．2组织：各种手术切除标本均一分为二，一半固定，一半冰冻(-80℃)，常规组织学处理，病理观察，备用。 2．3方法 2．3．1 SELDI-TOF-MS和IMAC-Cu蛋白芯片检测血清蛋白质组。 2．3．2候选相关蛋白质检索：根据差异蛋白质的质核比(相对分子质量)，在SWlSS-PROT蛋白数据库中通过http：//us．expasy．org/tools/tagident．html网站检索与其相匹配蛋白质，分子量允许的误差范围<0.5％。 2．3．3 CGH技术。 2. 3．4 RT-PCR技术RNA提取使用Promega公司SV Total RNA Isolation System试剂盒提取，方法按手册建议进行。反转录使用Promega公司ImProm-Ⅱ<'TM> Reverse TranscriptionSystem试剂盒，方法按手册建议进行。 2．3．5数据处理与统计学分析所有蛋白质组检测数据先用Proteinchip Software 3.1进行统一校正，使总离子强度及分子量达到均一化。再用Biomarker Wizard软件方差分析，计算不同组相同质荷比的蛋白质含量的P值，通过P值可以比较每个获得的蛋白质峰在各组间蛋白质表达的差异性的显著程度。P<0.05被认为差异具有显著性。各组间蛋白表达差异等数据采用SPSS10.0统计软件处理，采用X<'2>检验和Kappa检验等统计学方法对资料进行统计学分析，取a=0.05。 4．结论 4．1 双源癌、单发食管癌、单发贲门癌分别与对照组蛋白质组对比发现有6种候选蛋白在3种肿瘤中同时存在，占双源癌候选蛋白的60％(6/10)，明显高于单发食管癌(33％)和单发贲门癌(30％)所占的比例。提示该6种蛋白为双源癌的重要候选蛋白；同时提示该地区双源癌、单发食管癌和单发贲门癌患者之间存在相似的分子基础。 4．2 CGH检测显示双源癌组织中，食管鳞癌基因组DNA拷贝数异常的频发部位分别是6p(75％)，13q(50％)(扩增)和8p(50％)，17p(50％)(丢失)，与同一个体贲门癌基因组DNA拷贝数异常的频发部位相一致的分别是13q(50％)，6p(50％)(扩增)和17p(50％)(丢失)，进一步提示双源癌患者食管癌和贲门癌具有相似的分子基础。 4．3 SELDI-TOF-MS和CGH分别检测的侯选蛋白和侯选基因的吻合率为81％，提示这两种技术有较高的重复性和特异性，所发现的候选蛋白和基因可能是食管质门双源癌癌变的重要分子基础。 4．4 通过对单发食管癌和单发贲门癌不同病理分期的蛋白质组分析，发现4种与单发食管癌不同T分期密切相关的蛋白质；其中11730.18Da、9295.28Da等2种蛋白质与单发食管癌淋巴结转移和贲门癌的分化程度密切相关，提示该组蛋白是单发食管癌和贲门癌预后的重要分子基础。 4．5 COX7C和Beta-defensin1-2-3在正常组织中mRNA均为阴性，在双源癌组织中高表达，与血清蛋白质高表达一致。提示利用SELDI-TOF-MS检测出的侯选蛋白参与了食管/贲门双源癌的发生，为筛选肿瘤标志物提供了重要的技术平台。

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作者
冯笑山;
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作者单位

郑州大学;

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授予单位郑州大学;
学科内科学(消化)
授予学位博士
导师姓名王立东;
年度 2007
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正文语种中文
中图分类食管肿瘤;
关键词
双源癌; 食管癌; 贲门癌; 蛋白质组学; CGH; 分子机制;

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