兴安、长白及华北落叶松RAPD和ISSR分子标记的物种特异性鉴定

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本研究以中国北方地区的主要乡土落叶松树种一兴安落叶松、华北落叶松和长白落叶松的针叶及种子胚乳为研究材料，采用现代的RAPD和ISSR分子标记和其它分子生物学技术对三种落叶松进行不同物种的种间鉴别，并对RAPD分子标记技术扩增出的物种特异片段进行回收测序，转化为SCAR引物，为落叶松不同物种的种间鉴别提供了新的分子鉴定方法。采用改良的CTAB法分别对三种落叶松的针叶和种子胚乳进行了基因组DNA提取，确定了针叶和种子胚乳DNA的提取方法；通过以dNTP，Mg2+，引物，Taq酶为变量进行梯度对比，确定了RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反应体系和反应程序，RAPD-PCR反应体系为总体积20ul，模板DNA1.5ul(约30ng)，dNTP(2.0mM)1.5ul，10×Buffer2ul，Mg2+(25mM)1.6ul，引物(4uM)2ul，Taq酶0.2ul(1U)，去离子水11.2ul，反应程序为：93℃预变性3min；93℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min。ISSR-PCR反应的反应体系为：总体积20ul，模板DNA1.5ul(约30ng)，dNTP(20mM)2.0ul，10×Buffer2ul，Mg2+(25mM)1.6ul，引物(4uM)2ul，Taq酶0.2ul(1U)，去离子水10.7ul，反应程序为：93℃预变性3rmin；93℃变性30s，55℃/57℃/60℃/63℃(由不同引物而定，一般为引物的Tm+1)退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min。选取47个RAPD随机引物和20个ISSR引物分别对所提取的针叶及种子胚乳DNA进行引物筛选，得到鉴别三种落叶松苗木的3个RAPD引物，分别为OPB-11，OPN-07，OPX-14，鉴别三种落叶松种子的3个RAPD引物和2个ISSR引物，分别为OPB-11，OPN-17，OPX-14，ISSR-44，ISSR-46。将用于落叶松种子鉴别的三个RAPD物种特异片段回收、克隆后进行测序，根据测序片段两端的序列设计出3对物种特异的SCAR引物，分别为SCB1/SCB2；SCN1/SCN2；SCX1/SCX2。以此三对引物再对三种落叶松所有样品进行回检，相应的特异片段都被扩增出来。可能由于种内个体间引物结合位点突变，检出率没能达到100％，因此在鉴别时所抽取的样品要达到小样品数量、要随机并能够代表一个物种的特点。本研究为落叶松的鉴别工作提供了高效，可靠的鉴别方法。

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作者
曲丽娜;
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作者单位

东北林业大学;

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授予单位东北林业大学;
学科遗传学
授予学位硕士
导师姓名王秋玉;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类落叶松;树木分类学;
关键词
落叶松; 物种鉴定; 特异性鉴定; 分子标记; RAPD; ISSR; SCAR;

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