无冗余氨基酸鹅α干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

声明

摘要

1 前言

1．1 干扰素概述

1．1．1 干扰素的产生和分类

1．1．2 干扰素的分子结构

1．1．3 干扰素的理化特性

1．1．4 干扰素的生物学活性

1．2 禽干扰素的研究概况

1．2．1 禽Ⅰ型干扰素

1．2．2 禽Ⅱ型干扰素

1．2．3 禽Ⅲ型干扰素

1．2．4 鹅α-干扰素概述

1．3 酵母表达系统概述

1．3．1 酵母表达系统的优点

1．3．2 两种酵母表达系统简介

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物、禽胚、细胞

2．1．2 质粒、载体、菌株、和毒株

2．1．3 引物设计与合成

2．1．4 主要试剂及抗体

2．1．5 主要仪器

2．2 鹅α-干扰素多克隆抗体的制备

2．2．1 重组菌BL21／pWL-GoIFN-α的鉴定

2．2．2 大肠杆菌表达GoIFN-α与纯化

2．2．3 GoIFN-α多抗血清的制备及效价检测

2．3 鹅α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

2．3．1 鹅α-干扰素原始基因的获得

2．3．2 重组质粒pPICZαA-GoIFN-α的构建及鉴定

2．3．3 重组表达载体pPICZαA-GoIFN-α的转化入毕赤酵母GS115

2．3．4 重组表达载体pPICZαA-GoIFN-α转化入毕赤酵母X33

2．3．5 鹅α干扰素在毕赤酵母中的表达

2．4 高密度发酵工艺的初步研究

2．4．1 种子液的制备

2．4．2 发酵罐的组装与灭菌

2．4．3 高密度发酵重组毕赤酵母

2．4．4 发酵重组蛋白的检测

2．5 鹅-α干扰素抗病毒活性的测定

2．5．1 病毒的制备及效价测定

2．5．2 重组GoIFN-α蛋白抗病毒活性的测定

3 结果与分析

3．1 鹅α-干扰素多克隆抗体的制备

3．1．1 重组菌BL21／pWL-GoIFN-α的鉴定

3．1．2 大肠杆菌表达鹅α-干扰素表达与纯化

3．1．3 多克隆抗体血清效价检测结果

3．2 鹅α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

3．2．1 pPICZZαA-GoIFN-α酵母表达载体的构建

3．2．2 重组酵母的鉴定

3．2．3 GoIFN-α在毕赤酵母中的表达及鉴定

3．2．4 Dot-ELISA比较7株重组酵母的表达量

3．2．5 不同甲醇诱导浓度对蛋白表达量的影响

3．3 高密度发酵表达重组GoIFN-α

3．3．1 不同时间点酵母菌体湿重

3．3．2 间接ELISA法检测重组GoIFN-α蛋白的表达

3．3．3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及蛋白表达量

3．4 重组GoIFN-α抗病毒活性分析

3．4．1 摇瓶发酵表达的重组GoIFN-α蛋白抗病毒效价

3．4．2 高密度培养毕赤酵母表达重组蛋白的抗病毒活性

3．4．3 不同时间点表达重组蛋白的抗病毒活性

3．4．4 不同浓度重组鹅α干扰素对病毒增殖的影响

3．4．5 重组GoIFN-α蛋白的抗病毒活性阻断分析

4 讨论

4．1 表达载体的选择

4．2 获得无冗余氨基酸鹅α-干扰素的策略

4．3 不同转化方法的选择

4．4 重组鹅IFN-α生物学活性

4．5 糖基化修饰对蛋白的影响

4．6 提高外源蛋白表达策略

4．7 高密度发酵培养技术的初步探索

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文