声明
摘要
1 前言
1．1 化脓隐秘杆菌感染的概况
1．2 化脓隐秘杆菌病原学概述
1．3 化脓隐秘杆菌的主要毒力因子
1．3．1 溶血素pyolysin
1．3．2 神经氨酸酶Neuraminidases
1．3．3 胶原结合蛋白Collagen-Binding Protein
1．3．4 菌毛合成蛋白Fimbriae
1．3．5 其他毒力因子
1．4 胆固醇依赖性的溶细胞素
1．4．1 CDCs
1．4．2 PLO与CDCs
1．5 巨噬细胞
1．5．1 巨噬细胞与免疫
1．5．2 巨噬细胞的生物学功能
1．5．3 巨噬细胞源性的细胞因子
1．5．4 细胞凋亡及其途径
1．5．5 细胞凋亡的检测方法
1．6 研究的目的和意义
2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 试验动物、细胞
2．1．2 菌种与质粒
2．1．3 引物设计与合成
2．1．4 主要试剂及抗体
2．1．5 主要溶液的配制
2．1．6 主要仪器
2．2 化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达
2．2．1 plo的克隆与表达
2．2．2 兔抗His-PLO多克隆抗体的制备与反应性分析
2．2．3 表达蛋白的溶血活性及其多抗的抗溶血活性
2．2．4 溶血素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的检测
2．2．5 溶血素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子检测
3 结果与分析
3．1 化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达
3．1．1 plo基因的克隆
3．1．2 重组表达载体的构建
3．1．3 溶血素蛋白的原核表达
3．1．4 重组溶血素蛋白的Western blot鉴定
3．1．5 溶血素蛋白的纯化
3．2 兔抗His-PLO多克隆抗体的制备与反应性分析
3．2．1 Western blot分析
3．2．2 琼脂双扩散试验分析
3．2．3 兔抗His-PLO蛋白多克隆抗体效价测定
3．3 溶血试验
3．3．1 重组蛋白His-PLO的溶血试验
3．3．2 多抗中和His-PLO的抗溶血活性
3．4 溶血素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响
3．4．1 His-PLO对小鼠巨噬细胞损伤的形态观察
3．4．2 His-PLO蛋白抑制RAW264.7细胞生长
3．4．3 DNA Ladder分析
3．4．4 流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡率
3．4．5 caspase 3的活性检测
3．4．6 细胞因子检测结果
4 讨论
4．1 溶血素蛋白的原核表达
4．2 溶血素蛋白试验剂量的选择
4．3 溶血素与炎症反应
4．4 溶血素与细胞凋亡
4．5 溶血素、炎症反应、细胞凋亡与感染免疫
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士期间发表的论文
