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组织诱导性细胞外基质水凝胶制备及成骨成血管活性实验研究

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目的：以小肠粘膜下层（SIS）和脱钙骨基质（DBM）为基材，制备组织诱导性可注射细胞外基质水凝胶，探究其制备过程和方法、成胶的理化性质及水凝胶生物活性，并研究其体内外的生物相容性和成骨成血管活性。 方法：采用不同方法制备SIS，分别应用DNA含量、蛋白组学、扫描电镜等方法检测并比较三种方法对SIS脱细胞程度及成分、结构的影响；采用改良Urist法制备DBM，并检测其脱细胞程度和成分构成；将SIS和DBM颗粒充分溶解于含胃蛋白酶的酸性溶液中制备细胞外基质（ECM）溶液，通过调节pH和温度使其自组装形成合适浓度的SIS、DBM和SIS/DBM复合水凝胶材料。检测水凝胶成胶动力学和流变学；扫描电镜观察水凝胶材料微观形貌。将不同种类的ECM水凝胶与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养，通过死活染色、CCK-8检测水凝胶材料的细胞相容性和细胞增殖活性，通过茜素红染色、ALP活性、成骨相关蛋白基因等方法检测其成骨分化能力，RT-PCR检测成血管相关蛋白基因表达水平验证其成血管活性。将不同种类的ECM水凝胶注射至大鼠背部皮下，设置组别为SIS组、DBM组、DBM/SIS组和ColⅠ组。在术后7天处死5只动物，通过HE、Masson和CD31免疫组化染色检测水凝胶材料的生物相容性、成血管活性；制备大鼠5mm颅骨缺损模型，设置组别为SIS组、DBM组、DBM/SIS组和ColⅠ组。分别在术后4周、8周各处死5只动物，通过HE、Masson和免疫组化染色以及MicroCT检测水凝胶材料诱导骨缺损再生修复能力。 结果：三种方法制备的SIS和DBM，行HE和DAPI染色均无肉眼可见的细胞核，残存DNA含量分别为43.25ng/mg、21.01ng/mg、15.69ng/mg和24.53ng/mgECM干重。ECM结构在脱细胞之后均呈现出不同成分的破坏，可见胶原纤维排列凌乱，且有断裂现象。蛋白组学显示：SIS-1、SIS-2、SIS-3和DBM中检测出的蛋白种类分别为644、717、135和129种。以胶原蛋白的种类最多，共有21个亚型，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、14、16型胶原蛋白，以Ⅰ型胶原的相对表达量最大。其中，Ⅳ、Ⅵ和14型胶原蛋白为SIS所特有，而Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ型胶原蛋白为DBM所特有。除胶原蛋白之外，纤维粘连蛋白（fibronectin）、蛋白多糖、VEGF、FGF、TGF-β和BMP-2也均检测出表达。SIS与细胞共培养表现出良好的细胞相容性。将ECM溶解之后，通过调节pH和温度，成胶动力学显示所有类型的水凝胶均能在1h内成胶，SIS/DBM复合凝胶成胶时间最短。流变学检测显示SIS、DBM和SIS/DBM凝胶材料的储存模量分别为40.33±0.57Pa、401.67±1.46Pa和487±6.08Pa。SEM显示DBM和SIS/DBM凝胶材料呈现出纳米胶原纤维交错分布，随机排列，具有良好的孔隙率和三维支架结构，SIS凝胶为多孔结构，未见明显纳米纤维。死活染色提示水凝胶材料具有良好的细胞相容性。CCK-8提示水凝胶对于BMSCs增殖具有促进作用。茜素红染色和ALP活性检测提示水凝胶材料能提高ALP活性并能促进成骨分化，以DBM/SIS复合水凝胶最为显著；RT-PCR结果显示与SIS、SIS/DBM凝胶共培养的HUVEC表达KDR、Notch1和Ang2显著高于DBM凝胶，具有统计学差异。ECM水凝胶皮下注射实验显示，所有ECM水凝胶均具有良好的注射性，HE、Masson染色可见SIS和DBM/SIS凝胶组新生血管较为明显，且CD31免疫组化染色可见明显的新生毛细血管分布；DBM组有少量新生血管，ColⅠ组未见血管形成，后两者与前两者有明显的统计学差异；所有组别均未见明显异位成骨迹象。大鼠颅骨缺损修复实验中，Micro CT定量检测结果显示SIS、DBM、SIS/DBM和ColⅠ凝胶在4周和8周的BV/TV分别为29.2%、41.8%、66.32%和6.53%以及39.06%、56.5%、88.4%和8.9%。SIS/DBM复合凝胶的修复效果明显好于其他三组，有显著的统计学差异。HE、Masson染色显示SIS/DBM复合凝胶中可见明显的新骨形成，DBM组次之，两者均明显强于SIS凝胶和ColⅠ凝胶，8周时修复效果明显好于4周；ALP和OCN免疫组织化学染色结果显示SIS/DBM复合凝胶组和DBM凝胶中，ALP和OCN高度表达，明显高于SIS凝胶和ColⅠ水凝胶组。 结论：经过适当脱细胞方法制备的SIS和DBM，可保留其大部分天然细胞外基质（ECM）的结构和活性成分。ECM酸溶液经调节pH和温度后可制备可注射水凝胶，具有良好的理化特性、生物相容性和成血管及成骨诱导活性，能原位诱导血管形成和新生骨形成，促进骨缺损再生修复，可作为一种良好的组织诱导性生物材料。

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