Intelectin基因在哮喘气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP表达中的作用

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第一部分Intelectin基因在哮喘的气道高反应性、气道炎症、粘液分泌及T淋巴细胞分化中的作用
　　目的：观察Intelectin（ITLN）基因在小鼠哮喘模型中对气道高反应性、气道炎症、粘液分泌的影响，并探究其在哮喘T淋巴细胞分化中的作用。
　　方法：我们选择C57BL/6J品系的小鼠构建ITLN shRNA转基因小鼠（即ITLN KD小鼠），并构建卵清蛋白（OVA）和屋尘螨（HDM）两种哮喘模型。通过小鼠肺功能仪检测哮喘模型中各组小鼠在不同浓度乙酰甲胆碱的激发下表现出的气道阻力，并计数肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等的分类计数。此外，我们根据小鼠肺组织石蜡切片的HE染色，对小鼠气道周围炎性细胞的浸润程度进行评分，比较各组小鼠的气道炎症情况。对粘液分泌的评估我们采用实时荧光定量PCR(realtime-PCR)法检测小鼠肺组织中粘液表达基因 Muc5ac的mRNA表达水平、免疫组化法检测小鼠肺组织石蜡切片中Muc5ac的蛋白表达水平及小鼠肺组织石蜡切片糖原染色（PAS）等方法。还用ELISA法检测了各组小鼠外周血中OVA特异性 IgE的含量。为探究ITLN在支气管哮喘T淋巴细胞分化中的作用，我们首先将各组小鼠肺组织匀浆提取RNA，用realtime-PCR法检测各组小鼠肺组织中Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达水平，再用ELISA法检测BALF中这些Th2型细胞因子的浓度。为进一步验证ITLN参与了哮喘Th2细胞分化，我们采用流式细胞术标记各组小鼠肺组织及纵隔淋巴结中T细胞亚群，并比较各组小鼠肺组织及纵隔淋巴结中Th2型细胞（IL-4+CD4+）的比例。
　　结果：在小鼠OVA哮喘模型中，野生型（WT）哮喘组小鼠在对不同浓度乙酰甲胆碱激发时气道阻力显著升高，而ITLN KD哮喘组的气道阻力与WT哮喘组相比明显下降。在对各组小鼠BALF细胞计数后发现，ITLN KD哮喘组BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数均明显低于WT哮喘组。小鼠肺组织HE染色的气道炎症评分结果提示，ITLN KD哮喘组的炎症评分比WT哮喘组的下降50％以上。对粘液分泌的评估结果显示与WT哮喘组相比，ITLN KD哮喘组在Muc5ac的mRNA及蛋白表达水平、PAS染色的阳性细胞计数上均明显低于WT哮喘组。此外，我们还发现OVA特异性 IgE含量在WT哮喘组的外周血中显著升高，而在ITLN KD哮喘组中的表达明显被抑制。在HDM小鼠哮喘模型中，气道高反应性、气道炎症和粘液分泌均得到了与 OVA哮喘模型相似的实验结果。在探究ITLN在支气管哮喘T淋巴细胞分化中的作用时我们发现，OVA哮喘模型中WT哮喘组Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达水平较正常对照组显著升高，而在ITLN的表达被抑制后，这些Th2型细胞因子的表达明显下降。我们用流式细胞术检测T细胞亚群时发现，WT哮喘组肺组织及纵隔淋巴结中Th2型细胞（IL-4+CD4+）比例较正常对照组显著升高，而在ITLN KD哮喘组中Th2型细胞比例较WT哮喘组明显下降。
　　结论：ITLN基因参与哮喘的气道高反应性、气道炎症、粘液分泌等病理过程，当ITLN的表达被抑制后，哮喘的气道反应性降低，气道炎症及粘液分泌均明显减轻。抑制ITLN的表达能使CD4+T淋巴细胞向Th2型细胞分化减少。
　　第二部分 Intelectin基因在哮喘气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP表达中的作用及机制
　　目的：探究Intelectin（ITLN）基因在哮喘中对气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和 TSLP表达的影响，并深入研究 ITLN是通过何种信号通路参与调控屋尘螨（HDM）诱导的气道上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的表达。
　　方法：我们利用第一部分的小鼠哮喘模型标本，将各组小鼠肺组织匀浆后取上清，用ELISA法检测IL-25、IL-33和TSLP的蛋白表达水平。为了验证ITLN在致敏早期即参与调控气道上皮细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的表达，我们用屋尘螨（HDM）连续三天致敏小鼠，检测肺组织中ITLN、IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平。随后，我们用HDM刺激人支气管气道上皮细胞株（BEAS-2B），检测ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平，并设计人的ITLN shRNA质粒，观察ITLN的表达被抑制后，HDM诱导上述上皮细胞因子的表达水平是否发生变化。在以上实验基础上，我们选择EGFR信号通路阻断剂PD153035和AG1478，及MEK信号通路阻断剂U0126干预BEAS-2B细胞，旨在观察阻断EGFR和MEK信号通路后，HDM诱导的IL-25、IL-33和TSLP的表达水平是否受影响。为了直观地反应ITLN是通过何种信号通路参与调控HDM诱导的气道上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的表达，我们将BEAS-2B细胞在HDM干预前先转染ITLN shRNA质粒抑制ITLN的表达，用Western-Blot方法检测EGFR和MAPK/ERK的磷酸化情况。
　　结果：在两种小鼠哮喘模型中，我们均发现抑制ITLN的表达后，小鼠肺组织中IL-25、IL-33和TSLP的表达水平被显著抑制。用HDM连续三天致敏小鼠后，ITLN和上皮细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平显著升高，而抑制ITLN的表达后，这些上皮细胞因子的表达也被抑制。在BEAS-2B细胞模型中，HDM刺激BEAS-2B细胞2h时，IL-33和TSLP的mRNA表达水平即开始增加，6h时ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平均增加，而用ITLN shRNA质粒或半乳糖（galactose）干预后，HDM诱导BEAS-2B细胞引起的IL-25、IL-33和TSLP的表达受抑制。当EGFR和MEK信号通路被阻断后，HDM诱导BEAS-2B细胞IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平均明显下降。随后Western-Blot结果显示，HDM刺激BEASA-2B细胞后能使EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平显著增高，而转染ITLN shRNA质粒抑制ITLN的表达后，EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平显著下降。
　　结论：HDM能引起气道上皮细胞 ITLN和固有免疫细胞因子 IL-25、IL-33和 TSLP的表达，当 ITLN的表达被抑制后，HDM诱导这些上皮细胞因子的表达也被抑制。ITLN通过参与EGFR和MAPK/ERK信号通路的活化调节HDM诱导的IL-25、IL-33和TSLP的表达。
　　第三部分 Intelectin在支气管哮喘患者气道中的表达及临床意义
　　目的：观察 Intelectin（ITLN）在支气管哮喘患者气道中的表达情况，探究其与气道嗜酸性粒细胞炎症的相关性。
　　方法：我们一共入组23例健康对照者和48例支气管哮喘患者，记录所有研究对象的基本信息、肺功能FEV1%预计值、支气管激发试验PD20值、外周血嗜酸性粒细胞数量及血总IgE含量。此外，所有纳入的研究对象均需留取诱导痰标本、气道刷片细胞及气道活检标本。我们对诱导痰进行处理后，对诱导痰中的细胞进行分类计数，并记录嗜酸性粒细胞所占细胞总数的百分比。经纤维支气管镜获取的气道活检标本需做石蜡包埋并切片，通过HE染色观察气道活检标本的结构，对结构清晰的组织切片做免疫组化观察ITLN在健康对照者和支气管哮喘患者气道中的表达情况。经纤维支气管镜获取的气道刷片细胞提取RNA，用real-time PCR法检测并比较ITLN在健康对照组和支气管哮喘组间的表达差异。同时检测外周血中ITLN的蛋白表达水平，为血浆ITLN作为支气管哮喘的生物标志物提供依据。最后，我们将支气管哮喘患者气道刷片细胞中ITLN mRNA的表达水平与诱导痰中嗜酸性粒细胞数量做相关性分析，了解ITLN与气道嗜酸性粒细胞炎症的相关性。
　　结果：健康对照组和支气管哮喘组两组在年龄和性别比上均无明显差异。支气管哮喘组的FEV1%预计值和支气管激发试验PD20值均明显低于健康对照组。而支气管哮喘组外周血嗜酸性粒细胞数量及血总IgE含量均明显高于健康对照组。免疫组化法检测的气道活检标本结果显示，ITLN主要表达在支气管哮喘患者的气道杯状细胞和气道粘膜下腺体内。支气管哮喘组的气道刷片细胞中ITLN的mRNA表达水平和外周血中ITLN的蛋白表达水平均明显高于健康对照组。通过相关性分析，我们还发现支气管哮喘患者气道刷片细胞中ITLN的mRNA表达水平与诱导痰中嗜酸性粒细胞百分比呈显著正相关关系（相关系数为0.622，P<0.0001）。
　　结论：ITLN在支气管哮喘患者的气道中表达明显升高，且主要表达在气道杯状细胞和气道粘膜下腺体内。支气管哮喘患者气道ITLN的表达水平与气道嗜酸性粒细胞炎症程度呈显著正相关。

著录项

作者
易玲玲;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科内科学(呼吸系病)
授予学位博士
导师姓名赵建平;
年度 2016
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R562.250.2;
关键词
支气管哮喘; Intelectin基因; 高反应性; 气道炎症; 粘液分泌; T淋巴细胞分化; 上皮细胞;

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