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利用酵母双杂交系统筛选并鉴定出与MCM4C末端结构域(MCM4-CTD)相互作用的蛋白

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1 绪论

1.1 癌症与DNA损伤

1.2 细胞周期与DNA损伤检验点

1.3 染色体重塑

1.4 蛋白质的相互作用与酵母双杂交

1.5 研究目的、意义

2 实验仪器、主要试剂、培养基

2.1 仪器

2.2 试剂、培养基

3 材料、实验流程及实验方法

3.1 材料

3.2 实验流程图

3.3 实验方法

4 结果与分析

4.1 重组质粒的片段和载体的获得

4.2 重组质粒的酶切鉴定

4.3 筛选出的阳性结果的鉴定

4.3.1 自激活的检测以及3-AT浓度的确定

4.3.2 筛库及阳性结果鉴定

4.4 酵母双杂交验证阳性质粒的相互作用

5 总结与展望

致谢

参考文献

附录 Ⅰ

附录 Ⅱ

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摘要

DNA复制的严谨性和准确性对于遗传信息的传递有重要的作用,微小染色体维持蛋白复合物(MCM complex)是由六个亚基组成的六聚体,在真核细胞的DNA复制过程中起解旋酶的作用。在DNA损伤(DNA damage)时,复制叉会停止,过度的解旋会产生过多的单链DNA(ssDNA)从而能引起复制叉及整个基因组的不稳定。研究发现, MCM复合物中的一个最保守的亚基 MCM4的 C末端结构域(MCM4-CTD),其编码基因的大小为648bp,可以调控整个MCM复合物,在停止的复制叉处阻止它过度解旋,防止产生过多的单链 DNA,这就预示着在 DNA损伤时存在DNA损伤反应过程中相关的MCM4-CTD的重要作用。我们利用酵母双杂交实验,将MCM4-CTD克隆到BD载体上,从酵母的cDNA文库中筛选并鉴定出与之相互作用的蛋白SNF12,它是染色体重塑蛋白复合物(chromatin remodeling complex) SWI/SNF中的一个亚基。由此我们推测出在DNA损伤反应的过程中,染色体的重塑活性也参与到DNA复制的调控中。

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