不规则钙振荡通过累积波宽和振幅调节转录和基因表达

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钙振荡是普遍存在的一种钙信号形式,可观察于几乎所有的非兴奋性细胞。钙振荡频率依赖性的调节机制已经被广泛接受,包括调节转录因子活性,细胞增殖、分化、迁移等。Dolmetsch等人早在1998年利用钙钳技术成功阐明了钙振荡调节转录因子活性的频率依赖性,频率依赖性的调节方式显著提高了钙信号的特异性和工作效率。与此同时,钙振荡频率协同H2O2高效率的调节转录因子NFκB的转录活性。转录因子NFAT磷酸化与非磷酸化的动力学研究解释了钙振荡频率如何调节了NFAT的激活进而影响NFAT的转录活性。研究者们对钙振荡特异性调节机制的研究一致的体现了频率依赖性的特点。然而,钙振荡频率依赖性调节的本质是什么?对此已有学者做了深入的研究,研究结果表明钙振荡频率调节的内在机制是累积波宽,累积波宽依赖性机制表现为钙离子浓度在某一阈值水平时的累积时间,相同时间内,规则钙振荡频率越大其累积波宽越大,频率越小其累积波宽越小,因此转录因子转录活性的频率依赖性实质是累积波宽依赖性。经过不断深入的探索,已对钙振荡参数调节下游生物学效应的机制有了深刻的认识。新的问题又出现,以往对钙振荡的研究主要基于人工钙振荡模型的建立,所建立的人工模型均为规则的钙振荡,然而在众多生理或病理生理状况下,刺激所诱发的细胞胞浆钙振荡表现为不规则的形式:振幅不齐,频率不均一,波宽不一致,并在细胞间表现钙振荡的异质性。例如缺氧后再灌注诱发内皮细胞不规则钙振荡,雌激素作用鼠卵母细胞诱发不规则钙振荡,组胺刺激Hela细胞诱发不规则钙振荡,趋化因子刺激中性粒细胞诱发不规则钙振荡,卵巢粒层细胞呈现高度不规则自发性钙振荡,膀胱平滑肌细胞不规则自发性钙振荡。于是生物相关性钙振荡表现为不规则性和异质性。那么基于规则钙振荡模型(低生物相关性)得出的结论是否同样适用于不规则钙振荡呢?于是应用10μM组胺刺激细胞,同时监测胞浆钙振荡和转录因子核转位,在单细胞水平研究生物相关性的不规则和异质性钙振荡调节下游转录因子活性的内在机制。为确切验证单细胞水平的研究结论,研究不规则钙振荡参数和下游生物学效应的因-效关系,实验应用钙钳技术灌流人脐静脉内皮细胞在群体细胞水平建立振幅相同、频率相同,累积波宽不同和振幅相同、累积波宽相同,频率不同的同质性的不规则钙振荡模型,对转录因子NFκB、STAT3转录活性及下游基因IL-8、VEGF的表达进行检测,发现振幅相同、频率相同,累积波宽不同时,NFκB及下游基因IL-8表达不同;振幅相同、累积波宽相同,频率不同时,NFκB、STAT3转录活性及下游基因IL-8、VEGF表达相同。单细胞水平的异质性不规则钙振荡和群体细胞水平同质性不规则钙振荡的研究结果表明生物相关性不规则钙振荡通过累积波宽和振幅调节下游生物学效应。
　　第一部分累积波宽和振幅调节转录—单细胞水平揭示相关性
　　目的：应用10μM组胺刺激过表达转录因子有NFκB或STAT3的人脐静脉内皮细胞,诱发不规则钙振荡,同时监测转录因子NFκB和STAT3的核转位,在单细胞水平研究生理性刺激下不规则钙振荡频率调节NFκB和STAT3的核转位的累积波宽依赖性调节机制及不规则钙振荡调节NFκB和STAT3的核转位的振幅依赖性机制。
　　方法：转染人脐静脉内皮细胞,使细胞过表达转录因子NFκB、STAT3标记有绿色荧光蛋白的融合蛋白。用10μM组胺刺激标记有钙离子荧光指示剂Fura-Red的转染细胞,利用共聚焦显微镜同时监测转录因子NFκB、STAT3转位变化和胞浆钙离子浓度变化。
　　结果：
　　1.单细胞水平研究生理性刺激下转录因子RelA转位活性的累积波宽依赖性机制和振幅依赖性机制
　　10μM组胺刺激转染了RelA-GFP质粒的人脐静脉内皮细胞产生不规则钙振荡,刺激时间60分钟。对各个细胞钙振荡频率和所对应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,应用four parameter logistic回归方法,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=112,p>0.05)。对各个细胞钙振荡累积波宽和所应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,应用four parameter logistic回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义(n=80,p<0.05,其中32个细胞钙振荡振幅未达到NFκB激阈值180nM)。对各个细胞钙信号振幅和所对应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,应用four parameter logistic回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义(n=164,p<0.05)。对细胞single spike Duration(振幅达到180nM)和所对应的Rel-A-GFP转位强度进行回归分析,应用two Parameter ModifiedⅠpower回归方法,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=40,p>0.05)。在单一频率分别为0.1min-1,0.2min-1,0.3min-1时,对各个细胞钙振荡累积波宽和所对应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义。累积波宽在窄范围时,对各个细胞钙振荡频率和所对应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,方程无统计学意义。对各个细胞钙振荡频率和所对应的累积波宽进行回归分析,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=112,p>0.05)。在细胞钙振荡所有均振幅达到NFκB激阈值180nM时,对各个细胞频率和累积波宽进行回归分析,应用Hyperbola回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意(n=42,p<0.05)。在细胞钙振荡所有均振幅达到NFκB激阈值180nM时,对各个细胞频率和所对应的RelA-GFP转位强度进行回归分析,应用Hyperbola回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意(n=42,p<0.05)。11个细胞在10μM组胺刺激后表现single spike,且没有达到NFκB激活阈值180nM。对钙振荡频率分布进行频数分析(n=112)。对钙振荡累积波宽分布进行频数分析(n=80)。
　　2.单细胞水平研究生理性刺激下转录因子STAT3转位(桨核转位)活性的累积波宽依赖性机制和振幅依赖性机制
　　10μM组胺刺激转染STAT3-GFP质粒的人脐静脉内皮细胞产生不规则钙振荡,刺激时间60分钟。对各个细胞钙振荡频率和所对应的STAT3-GFP转位强度进行回归分析,应用two Parameter power回归方法,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=157,p>0.05)。对各个细胞钙振荡累积波宽和所对应的STAT3-GFP转位强度行回归分析,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义(n=97,p<0.05,其中60个细胞钙振荡振幅未达到转录因子STAT3激阈值395nM)。对各个细胞钙振荡振幅和所对应的STAT3-GFP转位强度行回归分析,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义(n=271,p<0.05)。对各个细胞single spike duration(振幅达到395nM)和所对应的STAT3-GFP转位强度行回归分析,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=58,p>0.05)。在同一频率分别为0.1min-1,0.2min-1,0.3min-1时,对各个细胞钙振荡累积波宽和所对应的STAT3-GFP转位强度行回归分析,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意义。累积波宽在窄范围时,对各个细胞钙振荡频率和所对应的STAT3-GFP转位强行回归分析,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义。对各个细胞钙振荡频率和所对应的累积波宽进行回归分析,回归方程拟合度差,且方程无统计学意义(n=157,p>0.05)。在细胞钙振荡所有均振幅达到STAT3激阈值395nM时,对各个细胞频率和累积波宽进行回归分析,应用Hyperbola回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意(n=24,p<0.05)。在细胞钙振荡所有均振幅达到STAT3激阈值395nM时,对各个细胞频率和所对应的STAT3-GFP转位强度进行回归分析,应用Hyperbola回归方法,回归方程拟合度较好,且方程有统计学意(n=24,p<0.05)。58个细胞10μM组胺刺激后表现single spike,且没有达到激活阈值180nM。对钙振荡频率分布进行频(n=157)。对钙振荡累积波宽分布进行频数分析(n=97)。
　　结论：单细胞在生理性刺激条件下,转录因子NFκB和STAT3的核转位表现累积波宽依赖性和振幅依赖性,在单细胞水平上确切证明了不规则钙振荡频率调节下游生物学效应的内在机制是累积波宽,同时振幅亦是调节下游生物学效应的机制之一。
　　第二部分累积波宽调节转录和基因表达—群体细胞水平证实因-效关系
　　用10μM组胺刺激人脐静脉内皮细胞,观察不规则钙振荡现象。通过利用钙钳技术用零钙液和高钙液交替灌流人脐静脉内皮细胞建立四种不同振幅的钙振荡模型,以确定转录因子NFκB和STAT3的激活阈值。建立振幅相同、频率相同而累积波宽不同,振幅相同、累积波宽相同而频率不同的不规则钙振荡模型,为研究不规则钙振荡频率调节下游转录因子转录活性的内在机制奠定基础。灌流人脐静脉内皮细胞复制振幅相同、频率相同而累积波宽不同,振幅相同、累积波宽相同而频率不同的不规则钙振荡模型,对转录因子NFκB、STAT3转录活性及下游基因IL-8、VEGF表达进行检测,研究不规则钙振荡频率调节下游生物学效应的内在机制，进一步探讨累积波宽依赖性调节的内在本质。

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作者
宋珊珊;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科病理学与病理生理学
授予学位博士
导师姓名胡清华;
年度 2012
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病理生理学;
关键词
钙振荡; 调节机制; 转录因子; 基因表达;

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