IL-33参与小鼠实验性肠炎的作用及其机制HMGB1参与小鼠同种心脏移植早期排斥的作用机制

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克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)是一种慢性、复发性、原因不明的胃肠道慢性炎性肉芽肿性疾病,临床特征主要表现为腹泻、腹痛和肠梗阻,并有恶变倾向。克罗恩病确切病因迄今仍不清楚,一般认为可能与免疫、遗传、感染等因素相关。目前已知,Th1/Th17细胞应答在CD进展中起重要作用,另外免疫负调控机制紊乱也发挥关键性作用。上述免疫失衡状态可引发一系列下游炎性反应,从而致肠道组织损伤。
　　IL-33(又名NF-HEV或IL-1F11)属IL-1家族成员,广泛表达于全身组织,尤其在中枢神经系统、胃肠道组织显著高表达,提示其在这些组织病理生理过程中可能发挥作用。ST2L是IL-33唯一的特异性受体,主要表达于Th2细胞、肥大细胞、NKT细胞等表面,但Th1细胞不表达。IL-33功能十分复杂,在不同疾病及微环境中其作用各异。近期虽已有文献报道CD和溃疡病中IL-33表达升高,但其确切作用及机制尚未阐明。
　　本课题以TNBS所致小鼠实验性肠炎为CD模型,探讨IL-33参与CD的作用及可能机制。
　　一、重组小鼠IL-33的原核表达及兔源抗IL-33多克隆抗体的制备
　　本课题组前期研究已成功构建mrIL-33-GST原核表达质粒。复苏已转化mrIL-33表达质粒的大肠杆菌,IPTG体外诱导下扩增、表达、纯化,并剪切GST标签,获取高纯度IL-33并验证其生物活性。委托公司制备兔抗小鼠IL-33多克隆抗体。
　　二、rIL-33参与小鼠实验性肠炎的作用
　　1.TNBS所致肠炎模型小鼠肠道组织高表达IL-33
　　建立小鼠肠炎模型后第四天,采集模型组(TNBS)和对照组(乙醇)小鼠结肠组织并提取蛋白,免疫印迹检测其IFN-γ、IL-17、IL-33表达。结果显示:TNBS处理鼠IL-33、IFN-γ、IL-17表达均显著高于乙醇对照组,且IL-33主要以全长形式存在;模型组肠道组织IL-33 mRNA表达水平也显著升高。免疫组化检测结果提示:IL-33主要表达于形态类似单核细胞的细胞浆中。免疫荧光检测清晰显示,IL-33主要表达于F4/80阳性巨噬细胞;巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞同样证实表达IL-33。
　　2.rIL-33明显缓解TNBS所致小鼠肠炎
　　小鼠经TNBS处理后,立即分别给予rIL-33或兔源IL-33多克隆抗体(pAb),以PBS和兔IgG分别作为对照,以小鼠体重改变反映肠炎进展,结果显示:IL-33可显著缓解TNBS诱导肠炎的进展,而抗IL-33pAb可加剧肠炎进展(体重减轻)。结肠的肉眼观察评分也获相同结果。结肠组织免疫组化检测步显示,IL-33处理的小鼠结肠组织炎性细胞浸润显著减少。TNBS处理小鼠后第二天给予IL-33,同样可延缓肠炎进展。
　　三、rIL-33诱导肠炎模型小鼠由Th1应答向Th2应答偏移并诱生Treg
　　1.rIL-33诱导Th1/Th2细胞应答偏移
　　TNBS所致肠炎小鼠经IL-33处理,分析血清及肠系膜淋巴结(MLN)细胞培养上清中不同细胞因子水平。结果发现,IL-33处理组与PBS组相比,Th2型细胞因子IL-5、IL-13水平升高,Th1型细胞因子IFN-γ明显减少。提取肠道组织总mRNA分析细胞因子表达,获相同结果:rIL-33处理组Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-6、TNF-α)显著减少,Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)明显升高。实验结果还表明,IL-33处理的小鼠MLN和固有层单个核细胞(LPMC)中ST2+CD4+T比例增高,提示IL-33主要作用于ST2+CD4+T细胞而发挥效应。
　　2.IL-33诱生Treg
　　TNBS所致肠炎小鼠经IL-33处理,分析肠道组织Foxp3(Treg特征性转录因子)及其主要效应分子IL-10 mRNA表达。结果显示:rIL-33处理小鼠Foxp3和IL-10 mRNA表达显著高于PBS对照组。LPMC中Foxp3蛋白表达在两组间具有显著性差异。已有文献报道,Treg/Th17细胞失衡在CD发病中起重要作用,但本课题未发现rIL-33导致Th17细胞下降。
　　3.rIL-33诱生的Treg细胞在缓解TNBS所致小鼠肠炎进展中起关键作用
　　体内应用抗IL-4、CD25抗体分别中和IL-4并阻断Treg细胞免疫抑制功能,结果显示:抗CD25抗体可逆转rIL-33对肠炎的保护作用,而抗IL-4抗体不能明显逆转rIL-33的保护作用。
　　四、rIL-33诱生Treg细胞的机制
　　1.rIL-33促进CD103+IDO+DC分化
　　文献报道,CD103+DC(属耐受DC亚群)在维持肠道组织微环境免疫自稳中起关键作用。本实验结果显示:rIL-33处理实验性肠炎小鼠,MLN细胞和LPMC中CD103+DC比例明显升高,且CD103+DC亚群高表达 IDO。
　　2.rIL-33间接通过肠上皮细胞(IEC)而诱导CD103+DC
　　为探讨rIL-33诱生CD103+DC的机制,体外用GM-CSF刺激BMDC,同时给予外源性IL-33。结果显示,IL-33并不影响骨髓细胞向CD103+DC分化,且对已分化的BMDC也无影响。文献报道,IEC所产生TSLP/ALDH1A1/TGFβ1在CD103+DC分化中起重要作用。我们据此推测,IL-33可能作用于IEC。实验结果显示:IEC可表达ST2L(IL-33的受体);rIL-33处理肠炎小鼠IEC,可明显上调TSLP和ALDH1A1 mRNA表达;rIL-33处理小鼠IEC的培养上清可诱导BMDC上调CD103表达。
　　3.体外经 rIL-33刺激的肠炎小鼠IEC培养上清可上调DC表达CD103并促进Treg细胞分化
　　在建立小鼠TNBS肠炎后第四天,分离其IEC体外培养。结果发现:rIL-33可诱导IEC高表达TSLP/ALDH1A1 mRNA,而TGF-β1无明显变化(此结果与体内检测一致);经rIL-33刺激的IEC培养上清,可有效促进CD103+DC分化;培养上清诱生的CD103+DC可诱导nave T细胞分化为具有免疫负调节作用的Treg细胞。
　　五、结论
　　1.实验性小鼠肠炎模型中,肠道组织浸润的巨噬细胞可高表达IL-33。
　　2.给予外源性rIL-33可显著缓解TNBS所致小鼠肠炎进展。
　　3.TNBS所致小鼠肠炎模型中,IL-33可逆转Th1应答,并使之向Th2/Treg应答偏移。
　　4.IL-33主要通过诱导Treg细胞分化而缓解TNBS所致小鼠肠炎。
　　5.IL-33主要作用于IEC而促进CD103+IDO+DC分化,继而诱生Treg细胞。

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作者
段利华;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科免疫学
授予学位博士
导师姓名龚非力,方敏;
年度 2012
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类结肠疾病;病理生理学;
关键词
肠炎; 病理机制; 细胞诱导; 基因调控;

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