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标准化日本血吸虫病金标诊断试纸的临床研究

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金标试纸标准化体系及其临床研究

1 金标试纸的标准化体系

2 金标试纸临床研究

结 果

1 检测结果示意图

2 临床适用性研究结果

3 等效性结果

4 稳定性结果

讨 论

小 结

参考文献

附件1

附件2

附件3

附件4

综述

1 CIA在病原生物感染性疾病诊断中的应用

2 在食品检测中的应用

3 结语

参 考 文 献

致谢

硕士期间发表文章

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摘要

目的:
　　本课题的目的旨在:通过对标准化日本血吸虫病金标诊断试纸进行临床研究,以评价其临床适用性、稳定性及应用价值,为日本血吸虫病的诊断提供一种理想的诊断试剂。
　　目前,我国沿长江流域的湖南、湖北、江西、安徽和江苏等地,仍是日本血吸虫病流行疫区,因受洪水等自然灾害因素、南水北调工程的影响,其疫区渐有扩大趋势。面对如此严峻的日本血吸虫病疫情,在采取综合防治的同时,其诊断工作首当其冲。因为日本血吸虫病诊断的正确与否,可直接影响到该病疫情的真实性,乃至防治工作计划的制定、实施和防治效果的评价等诸多环节。因此,研发一种理想的诊断试剂,对于我国日本血吸虫病的防治工作显得十分重要。
　　在我国,日本血吸虫病的病原学诊断和免疫学诊断已被视为该病个体或群体化疗对象的确定,化疗、预防和传播控制效果,以及传播控制或阻断效果的评价依据。
　　迄今为止,日本血吸虫病病原学诊断,仍是该病确诊的唯一标准,其依据是能够从日本血吸虫流行疫区人群粪便中检出日本血吸虫虫卵或孵化出毛蚴,及直肠粘膜活体组织检出虫卵等。常见的病原学诊断方法有:直接涂片法、毛蚴孵化法、定量透明法、直肠粘膜活体组织检查等。随着近年来疫区人群感染率及感染程度的大幅下降,以及漏诊率高、操作繁琐、受检者依从性低等现象的突出,病原学诊断应用范围日益缩小。
　　与之相反,随着现代免疫学、分子生物学和基因工程学的不断发展,可用于日本血吸虫病辅助诊断的免疫学诊断方法及其应用领域愈发广泛。常见的免疫学诊断方法多以检测血清中特异性抗体为主,如间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
　　然而根据IHA及ELISA研发的日本血吸虫病诊断试剂,多存在反应时间长、需要特殊设备、价格较为昂贵等缺点,难以满足基层及现场筛查的特殊需求。尤其是以上诊断试剂不具备标准化生产及质量控制体系,更是与理想诊断试剂的标准相差甚远。
　　世界卫生组织(WHO)曾对理想诊断试剂提出以下要求:理想的诊断试剂应具备完善的标准体系、灵敏度高、特异性强、操作简捷、便于运输和保存,可用于病例诊断或筛查、流行病学调查、疾病监测以及抗药性监测等。
　　为研制符合WHO要求的日本血吸虫病理想诊断试剂,本课题组采用无种属特异性、具有高稳定性及活性的胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)作为显色体系,结合具有免疫反应与色谱层析优点的免疫层析技术,建立了一种快捷、简便的日本血吸虫病金标诊断试纸。在此基础上,又对已研制的金标试纸从原料、产品生产等各个环节予以标准化制备及质量控制,完善了日本血吸虫病金标诊断试纸的各环节标准化体系。标准化的日本血吸虫金标诊断试纸在实验室研发阶段,既体现出灵敏度高、特异性好、快捷简便、价格低廉等独特优越性。为验证其能够有效应用于日本血吸虫病的临床诊断,现将标准化日本血吸虫病金标诊断试纸进行临床研究,以评价其临床适用性、稳定性及应用价值,为日本血吸虫病的诊断提供一种理想的诊断试剂。
　　方法:
　　1.日本血吸虫病金标诊断试纸标准体系
　　1.1日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Sj-SEA)标准
　　取1300～1500条尾蚴感染新西兰兔(2.5±0.5 Kg)45天,提取肝脏内Sj-SEA;二喹啉甲酸(BCA)法测定其蛋白含量(5mg/mL);ELISA法检测 Sj-SEA免疫活性(Sj-SEA为1.25μg/ml和血清稀释度1:200)。1.2抗体标准
　　日本血吸虫病患者血清(Sj-S)50例(病原学和免疫学阳性);交叉反应抗体血清(病原学和免疫学阳性)80例,其中包括肝吸虫病20例、肺吸虫病15例、旋毛虫病15例、钩虫病15例和囊虫病15例;正常人血清50例。上述血清行艾滋病、肝炎检测均为阴性。
　　1.3胶体金标准化
　　胶体金含量为1％,颗粒直径为25nm。
　　1.4试纸包被标准
　　质控线:0.5mg/ml抗SPA二抗,线宽1.0mm;
　　检测线:1.4mg/mlSj-SEA,线宽1.0mm。
　　1.5试纸成品标准
　　试纸阳性结果应为质控线及检测线均出现红色条带,阴性结果则仅质控线出现红色条带;试纸成品检测标准抗体血清,应达到以下标准:
　　①阳性检出率:急性感染日本血吸虫病人群检出95％以上,慢性日本血吸虫病人群检出90％以上;
　　②交叉反应率:与常见寄生虫感染性疾病交叉反应率为5％以下;
　　③假阳性率:正常人阳性检出率(假阳性)为1％以下。
　　2.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸临床研究
　　2.1样本来源
　　参照《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》对临床研究单位的要求,本研究所用血清样本由荆州市血吸虫病专科医院、潜江市血吸虫病预防控制所、武汉市蔡甸区血吸虫病防治所三家血吸虫病专科防治单位提供。
　　2.2样本数量及选取标准
　　本次临床研究共收集1026例血清样本,其中100例非疫区健康人血清,926例病原学阳性血吸虫病患者血清(急性感染患者血清67例、慢性感染患者血清816例、晚期患者血清43例)。
　　选取标准:根据《中华人民共和国传染病防治法》﹑《中华人民共和国传染病防治法实施办法》﹑中华人民共和国卫生行业标准《血吸虫病诊断标准》(WS261-2006),分别选取血吸虫流行疫区急性﹑慢性﹑晚期不同感染阶段病人血清及非疫区人群血清,样本信息均含有受试者病原学检测结果及流行病学资料。
　　2.3方案设计
　　采用随机﹑单盲法进行临床研究。将上述1026例已知病原学检测结果的血清打乱次序、重新编号,并分装至于-20℃保存,应用标准化日本血吸虫金标诊断试纸进行检测,试验结束后揭盲。试验项目:①试纸检测结果与金标准(病原学检测)结果进行比较,评价该试纸的临床适用性;②试纸与已上市同类试剂“日本血吸虫抗体检测试剂盒(MPAIA)”进行同步对比试验,观察试纸与已上市诊断试剂的等效性;③长期试验,选666例血清(其中566例阳性血清、100例阴性血清),分别用于室温保存0个月、4个月、8个月及12个月的试纸检测,以观察试纸在室温下长期保存的稳定性;④加速试验,选74例血清(其中64例阳性血清、10例阴性血清),分别用于37℃温箱保存0个天、1天、2天、4天、6天及7天的试纸检测,以观察试纸高温保存下的稳定性。
　　2.4临床研究考核
　　严格执行标准操作程序，所有实验室检测均由同一人员完成，并详细记录试验过程及结果;采用灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、约登指数、调整一致率、kappa值等指标考核该试纸的临床适用性;采用SPSS 18.0统计软件及卡方检验考核试纸的等效性;采用灵敏度、特异度及一致率的散点趋势图考核试纸的长期稳定性及加速稳定性。
　　结果：
　　1 临床适用性
　　926例病原学阳性血吸虫病患者血清、100例非疫区健康人血清(Hp-S)合计1026例。其中阳性结果863例，试纸灵敏度为93.20％、特异度为93.00％、假阳性率为7.00％、假阴性率为6.80％、调整一致率为93.18％、约登指数为86.20％, kappa值为0.918。
　　2 等效性
　　926例病原学阳性血吸虫病患者血清、100例Hp-S，合计1026例血清。分别应用金标试纸及MPAIA试剂盒检测。两种诊断试剂同为阳性781例，同为阴性85例。经SPSS 18.0统计软件及卡方检验:
　　3.1 kappa值为0.926。
　　3.2 x2=2.03，P>0.05，两者差别无统计学意义。
　　3 稳定性
　　3.1 长期稳定性
　　试纸在室温环境下保存0个月、4个月、8个月及12个月的灵敏度分别为96.11％、95.05％、91.34％、80.04％;特异度分别为93.00％、93.00％、95.00％、99.00％;一致率分别为95.65％、94.75％、91.89％、82.88％。
　　3.2 加速稳定性
　　试纸在37℃温箱环境下保存0天、1天、2天、4天、6天及7天的灵敏度分别为93.75％、89.06％、85.94％、75％、59.38％、53.13％;特异度分别为100.00％、100.00％、80.00％、80.00％、100.00％、100.00％;一致率分别为94.60％、90.54％、85.14％、75.68％、64.87％、59.46％。
　　结论：
　　1.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸具有灵敏度高、特异度强等特点，其临床适用性较好;
　　2.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸与病原学诊断及以上市同类试剂“日本血吸虫病抗体检测试剂盒(MPAIAI)”有高度等效性;
　　3.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸在室温下保存，具有较高的稳定性，高温加速试验对试纸稳定性破坏较大，其保存应注意温度影响。
　　4.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸操作简便，不需特殊检测设备，实验人员不需进行上岗培训，利于大面积推广及普查使用;
　　5.标准化日本血吸虫病金标诊断试纸可以作为理想的血吸虫病诊断试剂，在临床检验及疫区血吸虫病防治机构使用，为该病的诊断和治疗提供有效的依据。

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