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SCGE/HepG2测试系统在饮用水消毒副产物遗传毒性评价中的应用研究

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第一部分 SCGE/HepG2测试系统检测15种DBPs遗传学损伤效应

第二部分 SCGE/HepG2测试系统评价水样提取物的遗传学损伤效应

第三部分 消毒副产物CH诱导HepG2细胞DNA损伤的遗传毒性机制研究

创新点

参考文献

综 述饮用水氯化消毒副产物水合氯醛的研究进展

致 谢

附录

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摘要

饮用水消毒是保证城市供水安全的的重要步骤，但饮用水在消毒过程中会产生大量消毒副产物（disinfection by-products，DBPs）。研究表明，一些DBPs具有明显的致突变性和遗传毒性，或者致癌性。至今已发现的DBPs超过600种，除了氯消毒会生成DBPs，采用臭氧、氯胺、二氧化氯等消毒方式也会产生大量DBPs。在日常生活中，人群对DBPs的暴露呈现长期性、暴露方式多样性、多种DBPs混合暴露的特点。运用流行病学或者慢性哺乳动物致癌试验等方法，评价众多DBPs混合暴露对人群健康的影响，在现有的技术条件下还难以实现。因此，构建一套短期遗传毒理学试验检测体系，对饮用水中DBPs混合暴露的遗传毒性进行快速、准确的评价具有重要的现实意义。
　　 目的：以单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis assay，SCGE）为核心技术，以人类来源的肝肿瘤细胞（human-derived hepatoma line，HepG2）为靶细胞，组成SCGE/HepG2测试系统，对饮用水中普遍存在且对人类健康威胁较大的5类共15种DBPs的遗传毒性进行分析和比较，评估该测试系统的检验效能和敏感性；运用SCGE/HepG2测试系统对氯化消毒前后水样提取物的遗传毒性特征及影响因素进行评价分析；探讨该测试系统在饮用水安全性评价体系中的可行性，为其纳入饮用水安全评价体系提供实验依据；应用SCGE/HepG2测试系统结合氧化损伤标志，探讨DBPs引起靶细胞遗传毒性损伤的机制。
　　 方法：
　　 1、应用SCGE/HepG2测试系统检测15种DBPs对HepG2细胞DNA损伤的作用。15种DPBs包括4种三卤甲烷、6种卤乙酸、3种卤乙腈、1种呋喃酮和1种醛类。每种DBP均设计5个染毒剂量，染毒剂量范围为0.001-10000μmol/l，同时设溶剂对照、阳性对照和空白对照。染毒时间均为4小时。采集细胞DNA迁移图，应用CASP软件分析采集的图像，尾部DNA含量、尾长和Oliver尾矩值作为判断细胞DNA损伤强度的指标。
　　 2、应用SCGE/HepG2测试系统评价水体样本的遗传毒性效应。分别于2009年的枯水期和丰水期，采集武汉市以长江和汉江为水源的两个水厂的原水、经氯化消毒处理后的出厂水以及管网末梢水。采用XAD-2大孔树脂对水样进行浓缩提取。应用SCGE/HepG2测试系统分析水样提取物的遗传毒性效应，同时分析水中DBPs的含量。水样提取物设为4个染毒浓度，分别相当于1.2、6、30及150ml水样/ml培养液，染毒时间为24小时。水中DBPs含量分析采用顶空毛细管柱气相色谱法。
　　 3、SCGE/HepG2测试系统结合氧化损伤标志探讨DBPs的遗传学损伤机制。选择消毒副产物水合氯醛（chloral hydrate，CH）为目标物，采用慢性细胞毒性试验，检测CH致HepG2的细胞毒性，计算细胞毒性潜力值。在含有或者不含抗氧化剂过氧化氢酶（Catalase）/或丁基羟胺茴香醚（Butyl hydroxylamine Anisole，BHA）的条件下，用SCGE/HepG2测试系统检测CH对HepG2细胞的遗传学损伤效应。测定CH染毒后的细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量；CH染毒系列分别为7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000μmol/l；染毒时间分别为4和24小时。
　　 结果：
　　 第一部分结果：根据引起HepG2细胞DNA明显损伤的最低浓度，将DBPs遗传毒性的强弱按类别排序如下：①4种三卤甲烷：一溴二氯甲烷（bromodichloromethane，BDCM）>一氯二溴甲烷（dibromochloromethane，DBCM）>溴仿（tribromomethane，TBM）>氯仿（trichloromethane，TCM）；②6种卤乙酸：碘乙酸（iodoacetic acid，IA）>溴乙酸（bromoacetic acid，BA）>二溴乙酸（dibromoacetic acid，DBA）>二氯乙酸（dichloracetic acid，DCA）>三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），氯乙酸（chloroacetic acid，CA）无明显的DNA损伤作用；③3种卤乙腈：二溴乙腈（dibromoacetonitrile，DBN）≈二氯乙腈（dichloroacetonitrile，DCN）>三氯乙腈（trichloroacetonitrile，TCN）；④属于呋喃类的3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮（3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone，MX）≈ TCA；⑤而属于醛类的CH ≈ DCA。在15种DBPs中，卤乙酸类的IA对细胞DNA的损伤作用最强，BA次之。SCGE/HepG2测试系统可检测出14/15种DBPs的遗传毒性，仅卤乙酸类的CA在测试系统中未显示出遗传毒性。
　　 第二部分结果：①汉江、长江水样中均检出TCM和BDCM，二者在消毒后水样中的含量均高于原水，且在枯水期汉江水样中的含量高于同期长江水样；②与溶剂对照相比，汉江水源原水、出厂水、管网末梢水提取物主要在中、高浓度时（30、150ml/ml）诱导HepG2细胞DNA损伤明显增加（P＜0.05或P＜0.01）；与同浓度原水相比，丰水期汉江水源出厂水提取物在低、中、高浓度（6、30、150ml/ml），以及管网末梢水提取物在低浓度（1.2、6ml/ml），引起DNA损伤明显增加；③与溶剂对照相比，长江水源原水、出厂水和管网末梢水提取物主要在中、高浓度（30、150ml/ml）诱导HepG2细胞DNA损伤明显增加（P＜0.05或P＜0.01）；与同浓度原水相比，枯水期长江水源出厂水提取物和丰水期管网末梢水提取物在高浓度（150ml/ml），引起DNA损伤明显增加（P＜0.05或P＜0.01）；④不论是汉江水源还是长江水源，枯水期水样提取物诱导的HepG2细胞OTM值均高于丰水期（P＜0.05或P＜0.01）；⑤不论是枯水期还是丰水期，汉江水源水样提取物诱导的HepG2细胞OTM值均高于长江水源（P<0.01）。
　　 第三部分结果：①消毒副产物CH引起HepG2细胞的％C1/2值为2.36×10-3 mol/l；②BHA或者Catalase单独染毒均未引起HepG2细胞的DNA损伤，40 μmol/l的CH单独染毒可使HepG2细胞的DNA损伤明显增加。不同浓度的BHA或Catalase与40 μmol/l的CH联合染毒时，DNA损伤较之CH单独染毒明显降低（P＜0.001）；③在染毒4小时的条件下，CH浓度达500μmol/l以上时，HepG2细胞内ROS生成量明显增加、GSH含量明显下降（P＜0.05或P＜0.01），但MDA和SOD含量没有明显的影响；④在染毒24小时的条件下，CH浓度达125μmol/l以上时，HepG2细胞内ROS生成量明显增加、GSH含量显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；高浓度的CH（1000μmol/l）可引起细胞内 MDA生成量上升和SOD含量下降（P＜0.05）；⑤相关分析表明，CH诱导的ROS含量的变化与GSH和SOD含量的变化呈负相关（P＜0.05或P＜0.01）、与MDA含量的变化呈正相关（P＜0.01）；GSH含量的变化与MDA含量变化呈负相关（P＜0.01）、与SOD含量变化呈正相关（P＜0.01）；MDA含量的变化与SOD含量变化呈负相关（P＜0.01）。
　　 结论：
　　 （1）5类共15种DBPs中，卤乙酸类对HepG2细胞的DNA损伤作用最强。DBPs对细胞DNA的损伤作用还因取代基而不同，碘代DBP的DNA损伤作用高于溴代DBP，溴代DBP对DNA的损伤作用则高于氯代DBP。
　　 （2）氯化消毒增加了地表水的遗传毒性；水样提取物的遗传毒性受到水文期和水源因素的影响，枯水期水样提取物遗传毒性高于丰水期，汉江水源水样提取物遗传毒性高于长江水源。
　　 （3）SCGE/HepG2测试系统能够快速、有效地检测15种DBPs和水样提取物的遗传毒性，结合氧化损伤标志还可用于DBPs致DNA损伤及氧化损伤机制的探讨。
　　 （4）建议将SCGE/HepG2测试系统纳入饮用水的安全评价体系中。

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