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肝脏去唾液酸糖蛋白受体的生物学特性研究及其特异性适配子的筛选与鉴定

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摘要

目的：
　　 1. 研究肝脏去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）大亚基异构体的产生机制、表达水平及其编码蛋白的特性，为进一步阐明ASGPR的生物学功能及以其为靶标的肝脏靶向治疗奠定基础。
　　 2. 筛选获得能够特异性高亲和力结合肝脏特异性去唾液酸糖蛋白受体的RNA 适配子，为开发诊断和治疗肝脏疾病的靶向性试剂和药物奠定基础。
　　 方法：
　　 1.从正常人肝组织和HepG2细胞中克隆ASGPR 大亚基H1的两种异构体H1a和H1b的cDNA 序列，测序并比对分析H1b的产生机制；实时荧光定量PCR检测正常人肝组织和HepG2细胞中H1a和H1b的表达比例，以及在HBV、HCV感染情况下和肝癌组织中H1b表达水平的变化.
　　 2. 合成H1b特异性多肽并与钥孔戚血蓝素（KLH）偶联，免疫小鼠制备H1b特异性多克隆抗体，鉴定抗体的效价和特异性；亲和柱层析的方法从人血清和HepG2细胞培养上清中分离并纯化可溶性ASGPR，采用特异性抗体通过Western blot 鉴定可溶性ASGPR的组成；免疫组织化学检测H1b 在肝组织中表达和定位。
　　 3. 合成一个长度为115nt含有25个随机序列的单链DNA 随机文库，通过体外转录构建出单链RNA 适配子随机文库，从肝组织中分离纯化ASGPR 大亚基作为靶蛋白，采用SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）技术筛选高亲和力的ASGPR特异性RNA 适配子；测序分析筛选适配子的序列，预测并分析其二级结构特点。
　　 4. 同位素32 P标记适配子，通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力；绿色荧光FITC标记适配子，鉴定其与肝细胞系HepG2和Huh7的特异性结合。
　　 结果：
　　 1.人肝组织和肝细胞系HepG2中普遍表达ASGPR 大亚基异构体H1a和H1b，H1b的cDNA 较H1a 缺失了一段117 nt的序列，该序列是ASGPR 大亚基编码基因的第二个外显子，其两端具有典型的AG/GT 序列，提示H1的两种异构体产生于对ASGPR mRNA的选择性剪接。
　　 2. 正常肝组织和HepG2细胞中H1a和H1b的表达比例分别为5.2:1和2.6:1，而且H1b的表达水平在HBV和HCV感染细胞中下降约60%，在肝癌组织中下降90%以上。
　　 3. 在从正常人血清和HepG2细胞培养上清中纯化的可溶性ASGPR 蛋白中，可以检测到H1b 蛋白单体以及H1b和H2 构成的多聚体；对肝组织进行的免疫组织化学检测显示H1b不能定位至细胞膜，而主要存在于细胞质中。
　　 4. 经过12 轮SELEX 筛选，适配子文库中与靶蛋白结合的适配子得到明显富集；对第12 轮文库中随机挑选的48个适配子进行测序并预测其二级结构，发现文库中适配子从结构上主要由两个家族构成，其占总适配子的比例分别为45.8%和33.3%；并找到一个适配子H1-A25与靶蛋白具有很高的亲和力，Kd 值为48.79nM。
　　 5、在膜结合测定实验和凝胶阻滞实验中，反应体系中不添加靶蛋白，或用无关蛋白替代靶蛋白，则不能检测到明显的适配子H1-A25和蛋白结合；而在反应体系中加入过量未标记适配子H1-A25，则能明显阻断放射标记适配子H1-A25与H1 蛋白的结合。
　　 6、FITC标记的适配子H1-A25 能结合至肝癌细胞系HepG2和HuH-7，但不能结合不表达ASGPR的HeLa细胞；加入ASGPR的多克隆抗体可部分阻断荧光标记适配子H1-A25与HepG2细胞或HuH-7细胞结合，而加入过量未标记适配子H1-A25 则几乎可以完全阻断荧光标记适配子H1-A25结合HepG2细胞的荧光信号。
　　 结论：
　　 1.人肝组织及肝细胞系HepG2和Huh7中普遍表达ASGPR 大亚基异构体H1a和H1b。
　　 2. 大亚基异构体H1b 编码的蛋白为分泌型H1。
　　 3. 血清中的可溶性ASGPR是由分泌型的H1和H2 构成的功能性复合物。
　　 4. 成功地筛选出了具有高亲和力的肝脏ASGPR特异性RNA 适配子H1-A25。
　　 5. 适配子H1-A25 能特异性靶向结合至肝细胞。
　　 本研究的创新点及意义：
　　 1. 首次发现人类肝脏去唾液酸糖蛋白受体大亚基H1 存在剪接异构体H1b，并证明此剪接异构体编码的分泌型蛋白参与构成功能性的可溶性ASGPR，从而完善了对可溶性ASGPR的认识，并为进一步全面系统探讨ASGPR的生物学功能奠定了坚实的基础。
　　 2. 本研究首次筛选得到了肝细胞特异性的RNA 适配子并鉴定了其功能，而对其进一步的改进和修饰将使其有望成为新的诊断和治疗肝脏疾病的靶向性试剂和药物载体。

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