电压门控钾通道和线粒体膜上ATP敏感钾通道在人体缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及调控机制的研究

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研究背景:目前，肺动脉高压和肺心病的发病率仍然居高不下。缺氧性肺动脉高压(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)是最常见的类型，其发病机制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收缩(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其两大病理生理基础。目前认为，缺氧引起的肺血管收缩并非完全依赖于血管内皮细胞，血管平滑肌细胞也可介导血管收缩反应。在影响血管张力的各种因素中，血管平滑肌细胞钾通道发挥着十分重要的作用。钾通道可能与肺血管收缩和重建都有密切的联系，因此，研究者将缺氧与钾通道的关系作为研究热点，但目前以人体肺动脉平滑肌细胞为研究对象的还比较少。缺氧可抑制肺动脉平滑肌细胞钾通道的活性，引起肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)去极化，达到一定阈值后，电压依赖性钙通道开放，引起细胞内钙离子浓度升高，作为重要的第二信使，钙离子促发肺动脉平滑肌细胞收缩、增殖和迁移，也可激活各种蛋白激酶和转录因子，进一步引起缺氧性肺血管收缩和肺血管重建，最终导致肺动脉高压。肺动脉平滑肌细胞已知有三种钾通道，分别是延迟整流钾通道(Kv)、钙激活的钾通道(Kca)和ATP敏感的钾通道(KATP)。目前的研究表明，Kv在控制静息膜电位及氧感受方面起着重要的作用。在缺氧性肺动脉高压的发生发展中，缺氧介导肺血管舒缩障碍的各种体液因子以及介导肺血管重建的各种细胞增殖因子形成了复杂的信号转导网络，这些网络之间的调控机制是怎样的，他们又是如何对钾通道进行调控的，对平滑肌细胞增殖和凋亡又是怎样调控的，关于这些的研究还不多，以人体肺动脉平滑肌细胞为研究对象的更少。线粒体膜上ATP敏感的钾通道(MitoKATP)是影响线粒体膜电位(△ψm)的重要因素，目前它在心肌细胞缺氧和缺血预适应中研究的比较多，在其它方面，尤其是肺疾病方面研究的甚少。MitoKATP同样是对缺氧非常敏感，MitoKATP在有氧的情况下通常是关闭的，此时△ψm处于垮塌状态；反之MitoKATP被激活而开放，△ψm去极化。线粒体、MitoKATP和Kv通道都是敏感的氧感受器，MitoKATP与Kv是否相互联系呢?与PASMCs的增殖是否有联系呢?另外PKC、钙离子和Bcl-2等在其中又起什么作用呢?基于此，本研究从离子通道水平和基因表达水平，利用分子生物学、免疫组织化学技术、膜片钳技术，激光共聚焦显微技术等多种实验方法，探讨Kv和MitoKATP在肺血管重建中的作用及其调控机制，为HPH的发病机制研究和防治提供基础资料。第一部分线粒体膜上ATP敏感钾通道在缺氧抑制人体肺动脉平滑肌细胞膜上电压门控钾通道中的作用目的：线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoKATP)在细胞缺氧信号传导中的作用已经开始被重视，它是影响线粒体膜电位(△ψm)的重要因素，MitoKATP开放引起△ψm去极化。本实验从MitoKATP入手，研究它在缺氧影响人体肺动脉平滑肌细胞膜电位及钾通道Kv1.5基因表达中的作用，旨在探索人类肺动脉高压、肺源性心脏病的发生机制，为找到新的防治方法的探索提供试验依据。方法：(略）结果：(略）结论：本实验结果显示，缺氧可以引起MitoKATP的开放以及△ψm的去极化，并进而抑制了Kv的功能，参与并影响了肺动脉高压的发生发展。至于缺氧是怎样引起MitoKATP开放的以及MitoKATP的开放又是如何影响Kv通道的，他们之间的信号传导途径还要在后续的实验中进一步研究。第二部分PKC在线粒体膜上ATP敏感钾通道影响人体肺动脉平滑肌细胞膜电位和Kv1.5基因表达中的作用目的：肺动脉高压和肺心病，目前其仍有较高的发病率。PKC信号传导通路在肺动脉高压中发挥重要作用。Kv通道在调节细胞膜电位上是最重要的，它是目前肺动脉高压发病机制研究的一个热点，但精确机制仍不清楚。Kv通道的表达和活性被许多因素调控，例如第二信使(cAMP,cGMP)和蛋白激酶。所有能影响Kv通道的因素都可引起血管收缩或舒张。近来，线粒体膜电位(△ψm)在细胞缺氧信号传导中的作用已经开始被重视，线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoKATP)是影响△ψm的重要因素，MitoKATP开放引起△ψm去极化。MitoKATP是否也参与了肺动脉高压的发生呢?MitoKATP与Kv是否相互联系呢?本试验以人体肺动脉平滑肌细胞为研究对象，利用分子生物学和膜片钳技术，研究MitoKATP对人体PASMCs膜电位及Kv1.5表达的影响，及其PKC在其信号转导中的可能作用，旨在探索人类肺源性肺动脉高压心脏病的发生机制，为找到新的防治方法的探索提供试验依据。方法：(略）结果：（略）结论：本实验结果显示，MitoKATP的开放可抑制Kv通道的活性和表达，可能参与并影响了肺动脉高压的发生发展，其中PKC在其中可能起介导作用，Diazoxide与R0-31-8220同时应用没有使Kv电流和Kv1.5的表达恢复到正常对照组水平，说明可能除了PKC以外还有其它的因素参与其中，有待进一步研究。第三部分线粒体膜上ATP敏感钾通道在缺氧性人体肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用目的：缺氧性肺动脉高压(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)的发病机制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收缩(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其两大病理生理基础。肺动脉平滑肌细胞增殖在肺血管重建中起十分重要的作用，但是其中的信号转导途径还不清楚。线粒体膜上ATP敏感钾通道(MitoKATP)对缺氧十分敏感，它是影响线粒体膜电位的重要因素。本实验从线粒体膜上ATP敏感的钾通道(mitochondrialmembraneATP-sensitivepotassiumchannel,MitoKAATP)入手，研究线粒体膜电位在缺氧性肺血管重建中的作用。方法：(略）结果：（略）结论：本实验结果显示，MitoKATP是缺氧引起肺血管重建通路中的一个重要环节，MitoKATP可能参与并影响了肺动脉高压的发生发展，至于它和缺氧之间的相互关系及其信号传导途径还要在后续的实验中进一步研究。第四部分Ca2+-MitoKATP通路在Kv通道的抑制介导人体肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用目的：肺血管重建是肺动脉高压的一个主要的病理特征。肺血管重建主要表现为肺动脉平滑肌细胞过度增殖，可能是由于增殖的促进和/或凋亡的抑制引起。但其中精确的机制尚不清楚。目前，Kv通道在肺动脉高压发生机制中的作用成为研究热点，Kv通道可能介导了PASMCs的增殖，但在人体肺动脉平滑肌细胞模型上研究很少。本研究是以人体PASMCs为研究对象，探讨Kv通道与肺血管重建的可能联系，以及探讨线粒体膜上ATP敏感的钾通道(MitoKATP)、细胞内钙离子和Bcl-2等因素在Kv通道介导肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用，旨在探索人类肺源性肺动脉高压心脏病的发生机制，为找到新的防治方法的探索提供试验依据。方法：分离出人正常肺动脉平滑肌细胞(humanpulmonaryarterysmoothmusclecells，HPASMCs)，进行常氧培养。分组情况：线粒体膜电位的检测和细胞内钙离子浓度的检测实验分为3组：①正常对照组；②4-AP(Kv通道特异性阻断剂)组；③4-AP+EGTA(细胞外钙离子鳌合剂)组；细胞增殖凋亡的检测实验分为5组：①正常对照组；②4-AP组；③4-AP+Diazoxide组；④4-AP+5-HD组；⑤4-AP+EGTA。利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、原位缺口末端标记(TUNEL)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Fura-2荧光测定细胞内钙离子浓度、免疫组化方法检测肺动脉平滑肌细胞Bcl-2的蛋白表达等方法分析PASMCs增殖凋亡情况；线粒体膜电位的检测采用Rhodamine-123fluorescence法。结果：（略）结论：本实验结果显示，Kv通道的抑制可以介导人体肺动脉平滑肌细胞的增殖；并且Kv通道的抑制还可以使MitoKATP开放和线粒体膜电位去极化，MitoKATP的开放可能是Kv通道抑制介导HPASMCs增殖信号转导通路中的一个重要环节，MitoKATP的开放或关闭可能参与并影响了肺动脉高压的发生发展；本研究的结果还发现细胞内钙离子浓度可能是Kv通道抑制介导MitoKATP开放激活通路中的一个重要信使，同时也在HPASMCs的增殖中有重要的作用。

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作者
汪涛;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科内科学(呼吸系病)
授予学位博士
导师姓名张珍祥;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肺疾病;
关键词
肺动脉平滑肌细胞; 电压门控钾通道; 蛋白激酶C; 细胞增殖; 缺氧性肺动脉高压;

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