肿瘤选择性复制腺病毒基因治疗载体的构建SMART技术克隆肿瘤转移效应基因的研究

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课题一、肿瘤选择性复制腺病毒基因治疗载体的构建目的：建立一系列肿瘤选择性复制腺病毒载体，实现腺病毒基因治疗载体对肿瘤细胞的靶向性，为下步结合有效的肿瘤作用靶点进行肿瘤基因治疗奠定基础。材料和方法：通过二次PCR方法对腺病毒基因组E1A蛋白特定区域进行不同长度的缺失突变；通过同源重组的方法共转染腺病毒骨架质粒pBHGE3和穿梭质粒pXC1至包装细胞293以获得重组病毒并进行鉴定；重组病毒扩增后对不同p53和pRb表型的肿瘤细胞以及正常原代培养的血管内皮细胞进行细胞内复制性检测和体外杀伤效应的检测，比较不同突变病毒间的作用区别。结果：成功获得重组突变腺病毒载体；通过对多株肿瘤细胞和正常原代培养血管内皮细胞的效应检测发现，重组病毒对多株肿瘤细胞有较明显的体外杀伤效应；其中一种病毒具有对肿瘤细胞的选择性增殖作用，另一种病毒的选择性增殖作用有待验证。结论：肿瘤选择性腺病毒具有特异性杀伤肿瘤细胞的作用，可以作为肿瘤基因治疗的有效载体。课题二、SMART技术克隆肿瘤转移效应基因的研究目的：建立一种全新的、基于基因功能的筛选手段——SMART(SuppressionofMortalitybyAntisenseRescueTechnique)技术，并通过对肿瘤凋亡效应基因的筛选验证该技术的可行性。方法：确定不同浓度的丁酸钠处理乳腺癌细胞株MCF-7后凋亡发生的进程；选择2.5mmol/Lol/L浓度丁酸钠诱导MCF-7细胞凋亡，并收集处于凋亡不同时段的细胞提取mRNA，合成的cDNA反向插入真核表达载体pcDNA3.1以构建反义cDNA文库。文库DNA随机转入HeLa细胞中，筛选出阳性转染克隆后按一定密度接种，用2.5mmol/L丁酸钠和300μg/mlG418同时筛选，至对照组细胞全部死亡，转染文库组仍有存活细胞克隆时停止丁酸钠筛选；存活克隆经扩增后提取HirtDNA并转化感受态细菌，获得的转化克隆扩增后酶切鉴定并测序，得到多个EST片段；经过生物信息学分析后选择数个EST片段进行初步功能验证。结果：2.5mmol/L丁酸钠诱导的MCF-7细胞凋亡在36h左右启动，于72h达到高峰。收集丁酸钠作用48h前多个时间点的MCF细胞，提取mRNA后建立的反义cDNA文库片段插入率大于90％，平均长度约为1.5kb，库容约为4×105；将此文库质粒DNA转染HeLa细胞，经过2步筛选得到阳性克隆后，HirtDNA提取转化，经酶切测序获得6个EST片度。经过生物信息学分析，选定1个进行了初步功能鉴定，发现均在丁酸钠作用MCF-7细胞后其mRNA水平一定时间内有不同程度的上调。结论：成功建立了SMART技术平台；利用该平台对丁酸钠诱导MCF-7细胞凋亡的效应基因进行筛选后得到多个有意义的EST片段并得到初步验证；对这些片段的功能有待进一步研究。　课题三、HDAC抑制剂TSA增强卵巢癌细胞株A2780腺病毒基因治疗效率的体外研究目的：腺病毒感染依赖于靶细胞表面柯萨奇-腺病毒受体(CoxsackieandAdenovirusReceptor，CAR)的表达。本研究通过观察组氨酸去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)抑制剂TrichostatinA(TSA)对卵巢癌细胞株A2780CAR表达水平的影响，探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中应用的可能性。方法：分别在TSA作用卵巢癌细胞株A2780前后检测CARmRNA和蛋白水平的表达，同时采用流式细胞技术测定病毒转染效率，细胞生长抑制试验评价腺病毒携带的胸苷激酶(ADV/TK)的体外抗瘤效应。结果：TSA处理后细胞内CARmRNA和蛋白表达明显增高；通过GFP/ADV的表达检测，转染病毒前以一定浓度TSA处理A2780细胞48h后，转染效率较未处理细胞组增高～6倍，同时ADV/TK介导的体外杀伤作用增强了6～10倍。结论：TSA可以增强针对肿瘤细胞的腺病毒基因转染效率，为增强肿瘤的基因治疗效果提供了可能方法。

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作者
陈刚;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科妇产科学
授予学位博士
导师姓名马丁;
年度 2005
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肿瘤治疗学;卵巢肿瘤;
关键词
腺病毒载体; 基因治疗; 溶瘤病毒; 反义核酸技术; cDNA文库; HDAC抑制剂; 卵巢癌;

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