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利用腺相关病毒标记特定环路神经元及其细胞核的分离与DNA甲基化研究

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摘要

缩略语表

符号说明

1．研究背景

1．2．1．DNA甲基化

1．2．2．神经元分离方法

1．2．3．海马-内嗅皮层环路

1．2．4．腺相关病毒的生物学特性及其应用

2．目的与意义

3．材料和方法

3．1．实验材料

3．1．1．质粒、菌株、细胞系及实验动物

3．1．2．主要药品、试剂、仪器

3．1．3．培养基、缓冲液成分

3．2．实验方法

3．2．1．AAV核心质粒的改造及构建

3．2．2．腺相关病毒的制备

3．2．3．鼠脑立体定位注射、取脑及脑切片

3．2．4．分离带标记细胞核实验流程

3．2．5．单细胞DNA甲基化测序建库方法

3．2．6．DNA甲基化测序数据的生物信息分析流程

4．结果与分析

4．1．对INTACT技术实验条件的摸索与完善

4．2．其他AAV示踪工具的构建与功能验证

4．3．单细胞DNA甲基化测序建库及生信分析

4．4．总结

5．讨论与展望

5．1．AAV载体容量的扩增

5．2．单细胞DNA甲基化分析在医学检测的应用

参考文献

致谢

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摘要

大脑作为人体最为复杂、精密的器官，由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络，从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性，不适用于单神经元研究，同时，不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法，并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
　　在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中，本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag，分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证，转染后的细胞通过荧光显微镜观察，可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮，说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证，未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能，本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS，并对其进行活体注射，在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元，成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记，从而排除上述可能性。
　　在分离被标记细胞核的研究过程中，本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中，首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心，以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获，所捕获细胞核阳性率约为70％，捕获率在65％～85％。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18％，因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净，该实验方法可己满足后续研究需求。
　　在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中，本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法，先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入，成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测，文库片段分布大小与预期相符(300bp～500bp)，同时条带明亮，满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析，发现文库测序质量较好，且组间因建库操作造成的差异较小，因此认为该方法具有较好的可重复性。
　　针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题，本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述，并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。

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