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Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫棉的抗虫性鉴定及新Bt(Cry1C*)基因在棉花上的遗传转化

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摘要

缩略词表

1 前言

1.1.1 Bt基因的分类和命名

1.1.2 Bt蛋白的杀虫机理

1.2 转Bt基因棉花的发展

1.3 转Bt基因抗虫棉的鉴定方法

1.3.2 转Bt基因抗虫棉中Bt蛋白的检测

1.3.3 标记基因的检测

1.4.2 转Bt基因棉花毒蛋白表达的空间动态变化规律

1.6 本研究拟解决的问题

2 试验材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 抗虫性检测的棉花品种

2.1.2 新型抗虫基因转化的棉花受体品种

2.2 试验方法

2.2.1 田间杂交及不同遗传背景抗虫材料的形成

2.2.2 田间杂交及不同生育期抗虫材料的形成

2.2.3 田间种植和管理

2.2.4 棉花基因组DNA的提取

2.2.5 转Cry1Ab/Cry1Ac基因棉花的PCR鉴定方法

2.2.6 转Cry1Ab/Cry1Ac基因棉花外源蛋白表达量的测定

2.2.7 转Cry1Ab/Cry1Ac基因抗虫棉的室内生物测定

2.2.8 Cry1C*基因的载体构建及遗传转化

2.2.9 转Cry1C*基因再生植株的PCR检测

2.2.10 转基因植株Cry1C*蛋白含量的测定

2.2.11 转Cry1C*基因植株室内抗虫性鉴定

3 结果与分析

3.1 抗虫棉外源Cry1Ab/Cry1Ac基因的PCR检测

3.2 不同抗虫棉花品种的抗虫性差异

3.2.1 不同抗虫棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白表达量的检测

3.2.2 不同来源棉花品种的抗虫性差异

3.2.3 Cry1Ab/Cry1Ac蛋白表达量与室内生物测定结果的相关性

3.3 抗虫Cry1Ab/Cry1Ac基因表达的组织特异性及环境的影响

3.3.2 同一棉花品种年度间外源Cry1Ab/Cry1Ac蛋白表达差异

3.4 不同遗传背景对Cry1Ab/Cry1Ac棉花抗虫性的影响

3.4.1 不同遗传背景对外源Cry1Ab/Cry1Ac蛋白表达的影响

3.4.2 不同遗传背景对Cry1Ab/Cry1Ac棉花抗虫性的影响

3.4.3 不同遗传背景Cry1Ab/Cry1Ac棉花Cry1Ab/Cry1Ac蛋白表达量与室内生物测定的相关性

3.5 不同熟性Cry1Ab/Cry1Ac棉花抗虫性差异

3.5.2 不同熟性Cry1Ab/Cry1Ac棉花的生物测定差异

3.5.3 棉花熟性与抗虫性的相关性分析

3.6 转Cry1C*基因植株的获取及抗虫性初步鉴定

3.6.3 转Cry1C*基因植株T1代叶片Cry1C*蛋白含量测定

3.6.4 转Cry1C*基因棉花T1代植株室内生物测定

4 讨论

4.3 影响转Bt基因棉花Bt蛋白表达的其它因素

4.3.1 抗虫Bt蛋白表达的组织特异性及环境的影响

4.3.3 材料方法对测定结果的影响

4.4 Bt蛋白表达量与室内生物测定结果的相关性

4.5 培育转Cry1C*基因棉花的意义

5 研究结论

参考文献

致谢

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摘要

据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,从1996年到2015年的20年间,全球转基因作物累计种植面积达到20亿公顷,其中,转基因棉花累计种植面积达3亿公顷。转基因作物为农户及消费者带来的利益不言而喻。转Bt基因抗虫棉的应用及推广有效地解决了棉铃虫害对棉花生产的影响。随着研究的不断深入,发现其存在几个问题:一方面,Bt基因在棉花体内的表达存在时空差异;另一方面,目前抗虫棉花品种选育普遍采用的方法是利用获得转基因应用安全证书的品种作供体,与非转基因棉花杂交,转Bt基因抗虫棉品种间Bt蛋白表达量差异较大,尤其是其杂交后代Bt蛋白的表达量差异很大,对棉花的抗虫育种造成很大困难;第三,抗虫基因单一,现有的抗虫基因主要用于防治鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella),使得棉田其他害虫如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)等对棉花的危害逐渐加重,其中,甜菜夜蛾于2001年被列入重要害虫的潜在爆发名单。
  本研究测定了不同抗虫棉花品种、不同遗传背景棉花品种杂交F1代及不同熟性棉花品种杂交F1代棉花Bt蛋白表达量的差异,探究Bt基因在棉花中的表达及遗传规律,为抗虫棉的育种工作提供理论依据;在保证Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时,尝试将Cry1C*基因转入棉花,研究其对棉花害虫的控制效果,保证抗虫棉花的健康发展。主要结论如下:
  1)连续两年对6个不同抗虫棉花品种不同组织器官中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量进行测定及室内生物测定,结果表明:不同棉花品种间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量及棉铃虫幼虫校正死亡率均存在显著差异,其中冈383和鲁6269两个棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量和棉铃虫幼虫校正死亡率均较其他几个品种高,Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在不同品种组织中的表达规律大体相同:苗期叶片>蕾期叶片>铃期叶片>蕾期小蕾>铃期小铃;
  2)不同遗传背景棉花杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但与抗虫亲本相比,F1代显著低于抗虫亲本;二代、三代棉铃虫幼虫校正死亡率在不同杂交组合间存在显著差异,说明遗传背景对棉花的抗虫性有影响。
  3)不同熟性棉花品种杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但F1代Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量显著低于抗虫亲本鲁6269;棉花熟性与各组织中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量、棉铃虫幼虫校正死亡率均不存在显著的相关性,说明棉花的熟性对其抗虫性没有显著的影响。
  4)得到转Cry1C*基因棉花T0代2株(能收到种子的),后续的转化工作仍在继续,T1代阳性植株22株,初步筛选到Cry1C*-5-7、Cry1C*-5-8、Cry1C*-5-14三个Cry1C*蛋白表达量较高,抗虫性好的植株。

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