影响丁香假单胞菌冰核收拾InaQ分泌活性效应基因的研究

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 冰核蛋白研究背景

1．1．1 冰核细菌与冰核蛋白简介

1．1．2 冰核蛋白结构与功能

1．1．3 冰晶核蛋白的应用

1．2 转座子Tn5背景

1．2．1 转座的概念

1．2．2 转座的分类

1．2．3 转座的遗传学效应

1．2．4 Tn5转座子的介绍

1．2．5 pUT mini-Tn5 Km2转座子

1．2．6 转座子的应用

1．3 转座子插入位点鉴定方法

1．3．1 质粒拯救法

1．3．2 反向PCR法

1．3．3 接头法

1．3．4 TAIL-PCR法

1．3．5 改进的TAIL-PCR法

1．4 柠檬酸合成酶

1．4．1 三羧酸循环

1．4．2 柠檬酸合成酶

1．5 研究目的与意义

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 所用菌株与质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 实验所需试剂

2．1．4 实验所用仪器

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌质粒抽提

2．2．2 大肠杆菌感受态细胞制备

2．2．3 丁香假单胞菌总DNA提取

2．2．4 DNA体外重组与克隆构建

2．2．5 突变文库构建

2．2．6 丁香假单胞菌INP分泌诱导

2．2．7 SDS-PAGE电泳

2．2．8 Western Blot实验

2．2．9 膜杂交实验

2．2．10 流式细胞仪分析

2．2．11 总RNA的提取

2．2．12 RNA纯化及检测

2．2．13 RNA的反转录

2．2．14 Real Time PCR

2．2．15 实验流程示意图

3．结果与分析

3．1 转座子mini-Tn5转座突变文库的构建与冰核蛋白InaQ分泌活性增强或减弱突变株筛选

3．3．1 丁香假单胞菌MB03菌株的mini-Tn5突变文库的构建

3．1．2 从MB03突变文库中筛选效应菌株

3．2 突变株中转座子插入位点的鉴定

3．2．1 反向PCR

3．2．2 半随机的TAIL-PCR

3．2．3 插入位点序列的BLAST分析

3．3 柠檬酸合成酶与INP分泌关系研究

3．3．1 表达补偿载体和补偿菌株的构建

3．3．2 INP表达的变化

4．小结

5．讨论

5．1 转座突变文库的意义

5．2 冰核蛋白的分泌机制研究

5．3 对插入位点的研究

5．4 柠檬酸合酶的作用

5．5 展望

参考文献

致谢