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发根农杆菌介导的柑橘遗传转化体系建立及转基因柑橘溃疡病抗性分析

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摘要

缩略词表(Abbreviations)

第一章 前言

1.研究背景

2.文献综述

2.1 发根农杆菌介导的遗传转化及其在柑橘遗传改良中的应用

2.2 DR5报告系统在侧根发生和植物个体发育研究中的应用

2.3 植物先天性免疫与抗病育种

2.4 柑橘溃疡病研究进展

3.本研究目的意义及内容

第二章 发根农杆菌MSU440介导DsRED1基因转化‘早金’甜橙及枳

1.引言

2.材料与方法

2.1 植物材料

2.2 培养基类型

2.3 外植体准备及转化

2.4 毛状根荧光检测、PCR鉴定及植株再生

3.结果与分析

3.1 毛状根诱导及荧光观察

3.2 共转化毛状根PCR鉴定

3.3 植株再生及表型分析

4.讨论

5.小结

第三章 发根农杆菌介导生长素报告体系DRS::GUS-YFP转化枳及植株再生

1.引言

2.材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3.结果与分析

3.1 枳毛状根诱导、GUS组织化学染色及YFP荧光观察

3.2 枳毛状根PCR鉴定

3.3 NAA及TIBA处理枳毛状根对DR5启动子生长素应答的影响

3.4 枳毛状根及其侧根发育过程中生长素的分布

3.5 枳毛状根再生植株

3.6 再生植株分子鉴定和表达分析

4.讨论

4.1 毛状根在柑橘根系生物学及基因功能研究中的应用前景

4.2 DR5::GUS-YFP应用于枳内源生长素分布和应答观察的可行性

4.3 发根农杆菌应用于柑橘遗传改良的前景

4.4 小结及后续研究设想

第四章 利用DR5::GUS-YFP体系观察枳内源生长素分布

1.引言

2.材料与方法

2.1 植物材料

2.2 试验方法

3.结果与分析

3.1 枳再生植株根中生长素分布

3.2 枳再生植株茎中生长素分布

3.3 枳再生植株叶内生长素分布

4.讨论

5.本章小结

第五章 转Xa21基因暗柳橙分子鉴定及溃疡病抗性分析

1.引言

2.材料与方法

2.1 试验材料

2.2 转基因材料嫁接扩繁

2.3 转基因植株分子鉴定

3.结果与分析

3.1 转基因材料嫁接存活统计及叶片形态观察

3.2 转基因植株分子鉴定

3.3 转基因植株Xa21基因表达分析

3.4 转Xa21基因暗柳橙抗病性分析

4.讨论

4.1 转基因植株Xa21基因表达水平及其与柑橘溃疡病抗性的关系

4.2 Xa21基因参与柑橘溃疡病抗性反应的机理

5.小结

参考文献

附录Ⅰ.作者简介及博士学习期间发表论文

致谢

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摘要

柑橘作为世界重要果树在各产区地方经济中占据重要地位。本研究以‘早金’甜橙及枳无菌苗上胚轴为外植体,建立了发根农杆菌介导的遗传转化和植株再生体系;在此基础上,将生长素应答体系DR5∷GUS-YFP融合基因成功导入枳,获得转化毛状根及再生植株;借助生长素报告体系对枳毛状根及其再生植株内源生长素分布进行了观察和阐述。本研究还对已获得的转水稻Xa21基因‘暗柳’甜橙(Citrus sinensis Osbeck‘Anliu’)进行了分子鉴定和抗病性分析。主要结果如下:
  1.以柑橘接穗品种‘早金’甜橙及砧木品种枳无菌苗上胚轴为试材,建立了发根农杆菌MSU440介导的红色荧光蛋白基因DsRED1转化柑橘及植株再生体系。发根农杆菌侵染20min,21℃共培养3d,上胚轴切段在添加400mg/Lcef的无激素MT基本培养基上培养2-3W可获得毛状根;利用PCR扩增及荧光观察的方法对转化毛状根进行了鉴定并以毛状根为材料进一步获得了转基因再生植株。‘早金’甜橙毛状根再生植株表现出株型矮化、节间短缩及根系发达等特征;枳毛状根再生植株与非转化对照相比,地上部分表型无显著差异,部分植株不定根有所增多。
  2.利用发根农杆菌MSU440将生长素报告体系DR5∷GUS-YFP导入枳,获得转化毛状根并再生植株。YFP荧光观察、GUS染色及PCR扩增均表明,双元载体及Ri质粒T-DNA已共整合到枳毛状根基因组;GUS染色表明,毛状根共转化率达68.3%。借助DR5∷GUS-YFP报告体系,对毛状根及其侧根生长素分布进行观察表明,毛状根及其侧根根尖生长素分布最多,主要集中在根尖静止中心和根冠小柱;侧根发育过程中,侧根原基早期发育阶段在毛状根特定中柱鞘细胞中出现生长素积累;侧根原基形成过程中在原基顶端积累生长素,逐步形成生长素分布梯度。DR5∷GUS-YFP在毛状根根尖的表达受生长素浓度调控,NAA处理增强其表达活性,TIBA处理则降低其表达活性。以毛状根为材料进一步建立了转基因植株再生体系。毛状根切段在含1mg/L 6-BA的MT固体培养基上首先诱导出瘤状愈伤组织并进一步发育成丛生芽,经芽伸长和再生芽生根途径形成完整植株。Southern杂交及qRT-PCR表达分析表明DR5∷GUS-YFP融合基因已稳定整合到枳再生植株基因组并均有表达。毛状根体系是枳根系发育研究的有效工具,发根农杆菌介导的遗传转化体系为柑橘遗传改良提供了新的方法。
  3.以转DR5∷GUS-YFP融合基因枳再生植株为材料,对根、茎、叶内源生长素分布及应答进行了观察;结果显示在根尖、茎尖及幼叶边缘分泌结构及气孔均有生长素累积;推测局部生长素积累与根尖及茎尖分生组织细胞持续分裂能力的维持有关,生长素还可能参与了叶片气孔和分泌结构的分化。茎表皮及皮层未观察到生长素积累,茎韧皮部生长素分布明显,推测茎尖及幼叶合成的生长素主要通过茎韧皮部向根运输。对生长素类似物NAA或生长素极性运输抑制剂TIBA处理下根、茎等部位DR5启动子应答反应进行了观察。NAA处理可增加根尖末端生长素积累,从而增强DR5∷GUS-YFP的表达;TIBA处理则减弱根尖生长素的积累,降低DR5∷GUS-YFP的表达;不同转化系对外源NAA处理的应答强度不同,R54转化系根尖对NAA的响应比R28更灵敏;相同NAA浓度处理下,其DR5∷GUS-YFP表达更显著。
  4.对转水稻Xa21基因‘暗柳’甜橙再生植株进行了分子鉴定和抗病性分析。利用聚合酶链式扩增反应(polymerase chain reaction,PCR),从转Xa21音柳橙再生植株中扩增出1.4kb左右预期大小的Xa21基因片段;Southern杂交分析表明Xa21基因以单拷贝的方式整合到‘暗柳’甜橙基因组。对T1-T8等8个转基因株系进行了qRT-PCR表达分析,表明Xa21基因在8个检测株系中均有表达,表达量大致可分为低(T1、T2、T3、T7、T8)、中(T4)、高(T5、T6)三个水平。离体叶片针刺接种试验表明,三个转化系均增强了对柑橘溃疡病菌的抗性,其中T4转化系抗病性最强。对水稻Xa21基因诱导柑橘先天性免疫的机理进行了初步分析。

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