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Molecular Epidemiology of Piroplasms in Pakistan,and molecular Characterization,and Functional Analysis of HSP90 Proteins of Babesia orientalis

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摘要

Chapter 1-Review of Literature

1．1 Babesia and Theileria

1．2 Heat Shock Protein 90(HSP90)

Chapter 2-Molecular Epidemiology of Theileria annulata in Pakistan

2．1 Introduction

2．2 Materials and methods

2．3 Results

2．4 Discussion

Chapter 3-Two Putative HSP90 Proteins in Babesia orientalis

3．1 Introduction

3．2 Materials and methods

3．3 Results

3．4 Discussion

Chapter 4-Conclusions and Future Prospects

Study Ⅰ

Study Ⅱ

References

List of Tables

List of Figures

APPENDICES

ACKNOWLEDGEMENT

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摘要

泰勒虫和巴贝斯虫是蜱传性红细胞内原生寄生虫，可感染世界范围内大多数家畜。这些寄生虫主要感染热带和亚热带地区的牛羊，导致畜牧业巨大的经济损失。虽然，在巴基斯坦已经确定一些梨形虫种类感染奶牛和水牛，然而，多数尚未在分子水平上确认。考虑到这些寄生虫的重要性，本文运用反向线性杂交试验(RLB)在巴基斯坦Punjab的Sheikhupura和Okara地区对奶牛和水牛进行分子流行病学调查，评价泰勒虫和巴贝斯虫种类的流行性和传播动态。实验对具有遗传多样性的18SrRNA基因和ITS序列进行了研究。简要地说，来自采样区的102份黄牛和水牛血液样本分别保存于血纸中，运输到中国武汉华中农业大学，农业微生物学国家重点实验室进行DNA的提取;并进行18SrRNA的V4高变区扩增和RLB分析。61份(59.80％)样品用巴贝斯虫/泰勒虫属特异性探针进行杂交试验，61份样品中仅检测到环形泰勒虫。六份样品只与泰勒虫/巴贝斯虫特异性探针杂交，而不与任何其他种属特异性探针杂交，暗示有新的物种或基因型存在。对这6份样品进行18srRNA和ITS序列的扩增，6份样品的18SrRNA序列和ITS序列与环形泰勒虫最接近，核苷酸同源性分别达到99.4-99.9％和88.2-93.1％。然而，在这6个样品和另外2个样品的18SrRNA序列和ITS序列中，发现了一个意想不到的基因多相性，它们可与环形泰勒虫探针进行特异性杂交。环形泰勒虫的患病率在不同的相关危险因素下差异显著(P＜0.05)，这些危险因素包括宿主相关因素（年龄，性别和物种）和环境/农场管理因素（地理区域，自然群体，住房制度，动物饲养和地板模式）。环形泰勒虫的患病率，黄牛(67.21％)显著高于水牛(50％，P＜0.05);母牛(71.43％)显著高于公牛(35.48％，P＜0.05);低龄牛(64.29％)显著高于成年牛(57.63％，P＜0.05)。环形泰勒虫的地区流行性同样差异显著高(P＜0.05)，Sheikhupura地区(67.27％)高于Okara地区(52.17％)。散养动物中泰勒虫流行率显著高于封闭的圈舍中动物(P＜0.05)。在水泥地面或部分水泥地面上饲养以及绳拴饲养的水牛泰勒虫病流行率较高。然而，本研究第一次在巴基斯坦地区，通过18SrRNA和ITS序列同时对水牛巴贝斯虫和泰勒虫的流行性进行调查。
　　此外，研究对两个东方巴贝斯虫HSP90假定蛋白进行了鉴定和特性的电脑模拟分析。计算分析对这两种蛋白质的结构和功能进行了预测。通过结构分析对这些蛋白与药物（HSP90抑制剂）之间的相互作用进行检测。对东方巴贝斯虫基因组中与HSP90高度同源的两个假定蛋白进行克隆和测序。BoHSP90-A基因全长2706bp，包括一段997位至1299bp的内含子。从cDNA中扩增得到该基因的全长CDS，包含了一个编码800个氨基酸的2403bp的开放阅读框（ORF），预测编码91.02kDa的蛋白。HSP90-B基因是一个无内含子的2349bp的ORF序列，预测编码797个氨基酸，大小约90.59kDa。兔抗重组BoHSP90蛋白阳性血清可识别感染牛红细胞裂解液中BoHSP90-A和BoHSP90-B蛋白，大小为90kDa。东方巴贝斯虫水牛抗血清可与重组BoHSP90-A和BoHSP90-B蛋白特异性反应，表明这些蛋白质可能是进入宿主细胞之前被胞外的子孢子或裂殖子所分泌。总体结构和功能的分析表明，HSP90的一些区域涉及ATP酶活性，蛋白结合和HSP90二聚化作用。同样地，通过蛋白结构配体相互作用分析可观察到，几个HSP90抑制剂可结合到BoHSP90-A和BoHSP90-B的ATP结合口袋上，这几个抑制剂包括格尔德霉素，Radamide，根赤壳菌素，dihydroxyphenylpyrazoles，嘌呤基衍生物(PU8，PU11)，1(2-phenol)-2-萘酚和3，4-二芳基吡唑间苯二酚(CCT018159)。这些结果表明，这两种蛋白质属于HSP90家族，并在东方巴贝斯虫中具有分子伴侣活性。

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