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秀丽小杆线虫钙粘蛋白CDH-7是晶体蛋白Cry5B毒杀线虫过程中的受体

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1 文献综述

1.1.2 苏云金芽胞杆菌中的杀虫活性物质

1.1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白

1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白毒杀昆虫的作用机制

1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白毒杀昆虫的作用模式

1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白毒杀线虫的作用机制

1.3.2 Cry毒素在动物、植物寄生线虫生物防治研究中的应用

1.3.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白毒杀线虫的作用模式

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1.1 菌株、质粒与引物

2.1.2 试剂与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 DNA分子相关操作

2.2.2 蛋白质相关操作

2.2.3 线虫相关操作

3 结果与讨论

3.1秀丽小杆线虫中cadherin进化关系分析

3.2 钙粘蛋白CDH-7突变体RB685对Cry5B产生抗性

3.2.1 生长抑制实验表明CDH-7(RB685)对毒素Cry5B产生5.07倍的抗性

3.2.2 产卵率实验表明CDH-7(RB685)对毒素Cry5B产生抗性

3.3 CDH-7能够与Cry5B发生相互作用

3.3.1 CDH-7的结构序列分析

3.3.2 Ligand Blot证实CDH7与Cry5B发生相互作用

3.3.3 基于ELISA的方法证实CDH-7与Cry5B发生专一性的相互作用

3.3.4 酵母双杂交实验探究CDH-7与Cry5B的相互作用

3.4 RNAi证实cdh-7表达沉默导致线虫对Cry5B产生抗性

3.4.2 cdh-7表达沉默导致C.elegans对Cry5B产生抗性

3.5 线虫中钙粘蛋白CDH-7介导Cry5B寡聚化

4 结论

5 讨论与展望

参考文献

致谢

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摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的晶体蛋白对昆虫和线虫具有高活性。目前，关于晶体蛋白对昆虫的毒杀机制研究的较清晰，并提出了“穿孔机制”和“信号传导机制”等作用模式，但是对于Cry毒素杀线虫机制的研究还较少，主要集中在Cry5B对秀丽小杆线虫(Caenorhabditiselegans)的作用机理方面，而且仅鉴定到线虫肠道的糖脂可作为Cry5B作用C.elegans的受体。
　　本课题组致力于Bt防治植物寄生线虫研究多年，在前期研究工作中，我们发现线虫取食Cry5B以后，会有类似于昆虫取食Cry1类蛋白后的激活和分子量变化等过程（Zhang etal.,2012）。此外，2012年Hui等，解析了伴胞晶体Cry5B的三维结构，发现Cry5B的三维结构与大多数杀昆虫的Cry蛋白的三维结构非常相似。综合这些信息，我们推测Cry5B作用线虫受体可能不仅仅只有糖脂，可能还存在类似Cry1类毒素作用于昆虫的穿孔模式。本研究围绕这个猜想开展了系列研究。
　　我们首先通过生物信息学分析发现秀丽小杆线虫基因组中存在11个钙粘蛋白(cadherin)家族成员。进化分析发现其中的钙粘蛋白cdh-7与昆虫中被证实的钙粘蛋白受体进化地位最近，并且cdh-7是线虫所特有的基因。据此我们将目标锁定cdh-7。作为有功能的受体，其突变以后会导致靶标对毒素的抗性。为了保险起见，我们从美国线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）获得了其中的9个钙粘蛋白突变体。生物测定表明，cdh-7和cdh-8的线虫突变体RB685和tm644与野生型N2相比对Cry5B毒素产生5.08倍和4.56倍的抗性，cdh-4的突变体表型为敏感，而其他的突变体则没有显著差异。这表明钙粘蛋白cdh-7和cdh-8的突变能够导致线虫对Cry5B产生抗性。为了进一步确定抗性表型是由钙粘蛋白引起的，我们利用 RNAi实验进行了证实，确定了cdh-7的基因沉默能够导致线虫对Cry5B产生抗性。但是cdh-7和cdh-8的线虫突变体对Cry5B毒素的抗性比糖脂受体突变体产生的抗性要低，推测钙粘蛋白受体不是Cry5B毒素作用线虫的杀虫主要途径，糖脂受体途径可能是Cry5B毒素作用线虫的主要途径。
　　受体与毒素蛋白都具有特异的相互作用。本研究通过亲和印记，斑点杂交和ELISA等蛋白相互作用实验，证实了线虫钙粘蛋白CDH-7与Cry5B存在着专一性结合。这进一步说明了CDH-7可以作为Cry5B作用于线虫的受体。
　　在Cry蛋白作用昆虫的机制中，钙粘蛋白受体的作用是促进Cry毒素的寡聚化，从而改变毒素的空间构象，利于其与昆虫中的第二受体结合。我们进一步探讨了CDH-7在Cry5B作用于线虫过程中的功能是否也具有促进毒素寡聚化的作用。我们用Cry5B处理秀丽小杆线虫野生型N2和cdh-7突变体线虫，在线虫取食36小时后，通过Western blot方法检测到Cry5B处理野生型线虫N2发生了寡聚化现象。而Cry5B在cdh-7突变体线虫中则没有检测到寡聚化现象。这些结果表明钙粘蛋白CDH-7能够介导Cry5B在秀丽小杆线虫中寡聚化的产生。这与昆虫中的钙粘蛋白受体作用方式类似。
　　本研究证实了秀丽小杆线虫中钙粘蛋白CDH-7是晶体蛋白Cry5B毒杀线虫过程中的受体，其功能是介导Cry5B在秀丽小杆线虫中寡聚化的产生。这些研究说明Cry5B作用秀丽小杆线虫存在穿孔途径，这是目前关于Cry5B作用线虫糖脂受体途径的补充，进一步丰富了我们对苏云金芽胞杆菌晶体蛋白杀线虫机制的认识，也将为动植物寄生线虫的生物防治提供理论基础。

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