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微小反向重复转座子(MITE)对水稻基因表达和基因组分化的作用及番茄特有miRNA基因的演化

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摘要

缩略语表

第一章 MITE对在水稻基因表达和基因组分化的作用

1.1 前言

1.1.1 转座子

1.1.2 微小反向重复转座子(MITE)

1.1.3 本研究的目的和内容

1.2 材料和方法

1.2.1 原始数据集及软件

1.2.2 分析方法和流程

1.3 结果与分析

1.3.1 从头鉴定MITE的方法RSPB

1.3.2 水稻基因组中的MITE家族

1.3.3 MITE随机分布在基因组非编码区

1.3.4 MITE家族在不同的时期发生快速扩增

1.3.5 MITE在水稻不同栽培品种之间引入多态性

1.3.6 MITE产生的正义/反义转录本

1.3.7 近1/4水稻小RNA由MITE产生

1.3.8 靠近MITE的基因表达水平低于远离MITE的基因

1.4 讨论

1.4.1 RSPB鉴定MITE的效率

1.4.2 水稻基因组中的MITE

1.4.3 MITE的扩增是偶发的

1.4.4 水稻基因组中MITE的分布和演化选择

1.4.5 源自MITE的小RNA

1.4.6 MITE对基因表达的影响

1.4.7 结论与展望

第二章 番茄特有MIRNA基因的演化

2.1 前言

2.1.1 植物miRNA

2.1.2 植物MIRNA基因的演化

2.1.3 本研究的目的和内容

2.2 材料与方法

2.2.1 原始材料及软件

2.2.2 分析方法

2.3 结果与分析

2.3.1 番茄和马铃薯miRNA预测

2.3.2 番茄特有MIRNA基因

2.3.3 番茄MIRNA基因在基因组上的分布

2.3.4 番茄特有MIRNA位点在茄属内的序列变化

2.3.5 sly-newt22位点在番茄物种分化过程中发生了显著变化

2.3.6 番茄特有miRNA的功能预测

2.4 讨论

2.4.1 MIRNA基因的预测

2.4.2 番茄特有MIRNA基因的演化

2.4.3 sly-newt22是伴随番茄演化进程而形成的MIRNA基因

2.4.4 结论和展望

参考文献

附录

附录1 水稻中的MITE家族

附录2 本研究中鉴定的番茄和马铃薯miRNA

附表2-1 番茄miRNA

附表2-2 马铃薯miRNA

附录3 本研究所使用的番茄材料

附录4 PCR检测茄属植物MIRNA位点同源序列

附4.1 CATB大量法提取植物基因组DNA

附4.2 PCR特异条带扩增及检测

附4.3 所用引物列表

附录5 作者简介

致谢

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摘要

微小反向重复转座子(MITE)被认为是截短的DNA转座子,它们具有DNA转座子共同的结构特征,包括末端反向重复(TIR)和侧翼的目标位点拷贝(TSD)。MITE的内部缺乏编码转座酶的序列,其转座需要依赖同源的自主型DNA转座子编码的转座酶。MITE往往在基因组内具有较高的拷贝数,不同家族的分化和演化模式有很大差异,但对一个物种内MITE家族群体扩增和积累的机制仍然知之甚少。以往的研究认为MITE主要分布在染色体臂上,且偏好插入到基因附近。这种MITE与植物基因的物理联系意味着MITE对基因表达和基因组演化都起重要作用。为了进一步了解MITE在基因组演化过程中扮演的角色,需要对基因组内的MITE进行全面鉴定,并研究其对基因表达和基因组分化的影响。本研究开发了一套基于BLASTN的从头鉴定MITE的方法,并系统研究了水稻基因组中的MITE。水稻栽培品种“日本晴”基因组中共有178,533个MITE相关序列,它们被划分为6个超家族,338个家族。这些MITE随机分布在染色体臂的非编码区。通过对MITE家族成员两两核苷酸差异度和系统发育树的分析,发现一些MITE家族是通过一轮或多轮的爆发式扩增形成的。不同MITE家族或亚家族之间扩增发生的时间差异很大。约有14.8%全长MITE位点在水稻栽培品种“日本晴”和93-11之间产生了有/无多态性。MITE插入到23,623(58.2%)个水稻基因附近。至少有7,887个MITE可以被转录出来,其中3,463个是与基因一同转录的。转录后的MITE序列至少可以形成1,130对潜在的正义/反义转录本对。MITE产生了23.5%的水稻小RNA,有些家族主要从末端产生小RNA,而另一些家族则主要从中间区域产生小RNA。51.8%源于MITE的小RNA是从远离基因的MITE产生的。全基因组分析表明与靠近MITE的基因表达水平显著低于远离MITE的基因。总而言之,MITE从基因表达和基因组多态性等多个方面为水稻分化引入了多样性。
   微小RNA(miRNA)是一类长度约为20-24 nt的内源非编码小RNA,通过与靶基因mRNA互补结合来抑制蛋白翻译或引发目标mRNA降解,从而调节靶基因的表达。动植物之间MIRNA基因的结构和miRNA的作用机制有明显的差别。近年来通过高通量小RNA测序技术发现了越来越多的miRNA,一些miRNA在远缘物种之间也相当保守,而另一些miRNA则只存在于某个物种或某个分类单元中,后者很可能是物种演化过程中“新生”的miRNA。目前已有一些模型来解释植物如何产生短的反向互补序列,从而演化成新生MIRNA基因。本研究首先根据公开的小RNA测序数据,从番茄和马铃薯两个近缘物种内分别预测出了213和266个miRNA,其中分别有76个和97个是本研究中新发现的miRNA。番茄中有70个MIRNA基因在其他物种中找不到同源基因,可以认为是番茄特有MIRNA基因。番茄特有MIRNA基因有45.7%位于内含子区域,同时也有51.4%位于转座子区域,比例显著高于保守的番茄MIRNA基因。有75.7%(53个)番茄特有MIRNA基因上下游共50kb的序列在马铃薯基因组中存在共线性区段,但只有52.9%(37个)能在马铃薯基因组中找到MIRNA基因的等位位点。选择部分位点的侧翼序列设计引物在茄属其他物种内进行PCR检测并测序,可以发现在茄属物种分化过程中发生的短片段反向复制、短片段插入或丢失、长片段插入或丢失等各类事件。在番茄和马铃薯从共同祖先分化的过程中,番茄新生MIRNA通过反向复制事件产生的比例并不高。新发现的slyl-newt22位点在马铃薯和番茄分化过程中很可能出现了基于转座子的重排和跨染色体移动,然后在番茄物种分化过程中进一步经过序列丢失,形成成熟的MIRNA基因。本研究的结果,有助于进一步了解植物miRNA的演化历程和调控功能。

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