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柑橘黄龙病昆虫介体-柑橘木虱的研究及九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建

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柑橘黄龙病,也称作青果病,是柑橘上最严重的病害之一。黄龙病防治至今还没有有效的根治方法。柑橘木虱(Diaphorina citri)是黄龙病唯一的传播媒介。九里香(Murrava paniculata)为芸香科植物九里香属植物,是柑橘木虱最喜食的植物之一,感染黄龙病后很少表现症状。九里香作为抗黄龙病材料已有研究,但关于九里香感染黄龙病菌后基因表达情况研究很少。
　　 本研究采集田间具有典型黄龙病症状的样品,并对样品嫁接进行室内生物学鉴定、PCR扩增确定柑橘黄龙病阳性样品。在室外自然条件下研究柑橘木虱对福建茶和芸香科植物的选择性,观察柑橘木虱在福建茶和九里香上的生活周期,并在室内条件下研究柑橘木虱不同龄期若虫和成虫的饥渴耐受时间。采用不同浓度海芋乙醇提取物处理柑橘木虱若虫和成虫,采用夹毒叶片法分别测定提取物对柑橘木虱致死率,研究海芋提取物对柑橘木虱的生物活性。比较九里香感染黄龙病的不同途径,找出最佳感染途径后,收集感染黄龙病的九里香作为研究材料,应用SSH方法构建了九里香感染黄龙病早期的差减cDNA文库,分离获得在黄龙病病程相关的相关的cDNA片段,从中筛选出与抗性相关的基因片段。利用高效热不对称PCR技术扩增感染黄龙病菌的九里香的STH-21的cDNA全长,旨在克隆九里香上与黄龙病相关蛋白的STH-21蛋白的全长定量检测表达情况。本文主要研究结果如下:
　　 柑橘木虱可在福建茶和九里香上生存繁殖,两者若虫历期和成虫历期差异较大,福建茶上若虫期(15.0-20d),成虫期(17-19d),对照九里香上分别是15.0～17.0d和20.0～23.0d,福建茶上生活周期和九里香上相近,福建茶上为39.0-44.0d,九里香为39.0-45.0d九里香上若虫发育为成虫成活率为16.9％。比九里香低。福建茶对柑橘木虱是一种可接受寄主而不是最适合的寄主.柑橘木虱对寄主选择性测定显示该虫在选择各寄主之间差异明显,最适寄主为黄皮和九里香,其次是柠檬,沙田柚、红江橙和桠柑差异不大,很少取食枳壳。耐饥渴能力测试结果表明,低龄若虫和高龄若虫在供水缺食物时平均存活时间分别为10.0～12.0h和39.0～40.0 h,成虫可存活69.0～75.0h；在缺水供食物的条件下,平均存活时间分别为8.0～8.8h和35.0～37.0h,成虫为48.0～50.0h,在缺水缺食物的情况下,平均存活为7.7～8.2 h和15.0～18.0左右,成虫为36.0～38.0h。水分能延长柑橘木虱存活时间,成虫的耐受能力强于若虫。海芋挥发性物质和不同浓度乙醇提取物毒杀效果表明:挥发性气体物质0.5h内对柑橘木虱有强效毒杀作用。各级浓度提取物乙醇溶液对柑橘木虱成虫和若虫均有不同程度的杀灭效果。10克/100mL对木虱才有很强的毒杀作用,3h时每组死亡的平均数量为9.3,7h后几乎全部死亡,校正死亡率分别为45.6％和98.4％。提取物浓度为5克/100mL时,3H和24h后每组的平均校正死亡率分别为23.5％和71.0％。随着浓度的降低到0.1克/100mL,平均校正死亡率分别为8.5％和11.5％基本失去了毒杀作用。
　　 采用汁液摩擦、注射和挤压法,接种2个月后不能在九里香植株体内检测到黄龙病菌；黄龙病阳性接穗红江橙(Citrus sinensis Osbeck)嫁接九里香能使黄龙病菌成功侵染九里香,但接穗不能抽芽。草地菟丝子(Cuscuta campestris)和虫媒柑橘木虱(Diaphorina citri)都能成功从阳性植株体内将黄龙病菌传播至九里香。柑橘木虱传“毒”效率结果显示:木虱在红江橙阳性植株上取食1.5h-2h就能携带黄龙病菌,病原从柑橘木虱传到健康的九里香上最短需要12h,单头木虱带菌就能使九里香成功感染黄龙病菌。温度对病原的传播效率有较大影响,气温高于35℃或低于15℃时,介体昆虫活力差,传播病原的效率较低,0℃温度下木虱几乎不传播病原。40℃时昆虫死亡率高,活力差。
　　 采用抑制差减杂交技术,构建了柑橘黄龙病菌侵染九里香后不同时段的混合样品SSH正向和反向文库。Nest-PCR结果表明,插入片段大小平均为400 bp大小从0.2 kb到1kb不等。通过反向Northern斑点杂交技术对两个差减文库中400个片段进行筛选(正向300个,反向100个),共获得了167个差异EST表达片段。其中黄龙病菌诱导寄主上调表达的基因115个,下调表达的基因52个。利用BLASTn和BLASTx对所得EST进行相似性分析,结果显示,目前在柑橘中报道的仅有10个,其它绝大部分来源于拟南芥、蓖麻属、和番茄等。在167个ESTs片段中,36％尚不能推断明确其功能,其余64％涉及抗病防御、转录、信号转导、能量、代谢、蛋白质合成等信号途径,提示黄龙病菌与寄主互作是一个多基因参与的过程。研究结果对认识黄龙病菌.寄主互作的分子机制和寻找抗病相关基因有理论与实践意义。
　　 半定量PCR用来检测文库中miraculin-like protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8,chlorophyll A/B binding protein片段感染黄龙病菌前期表达情况,结果显示,miraculin-Iike protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8属于上调表达基因,chlorophyll A/B binding protein属于下调表达基因,获得了九里香病程相关蛋白STH21基因的cDNA全长序列。该基因与葡萄属(fragaria)的同源性为68％,与马铃薯pSTH-21基因核酸序列的同源性为67％,与其它植物的同源性为50％～60％。半定量RT-PCR分析表明,黄龙病菌感染两周后该基因的表达量达到高峰。

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