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藕带多酚氧化酶性质及藕带保鲜初步研究

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第一章 文献综述

1 多酚氧化酶的国内外研究现状

1.1 多酚氧化酶的类型及作用机理

1.2 多酚氧化酶的提取与纯化方法

1.3 多酚氧化酶的相对分子质量(MW)及其测定

1.4 多酚氧化酶的结构

1.5 酶的化学修饰

1.6 影响多酚氧化酶特性的因素

2 果蔬的护色及硬化研究

2.1 果蔬的护色

2.2 果蔬硬化研究

3 课题的目的和意义

第二章 藕带多酚氧化酶的提取、分离纯化研究

1 材料、试剂与设备

1.1 试验材料

1.2 试剂

1.3 仪器设备

2 试验方法

2.1 藕带多酚氧化酶活性测定方法

2.2 蛋白质含量的测定

2.3 比活力的测定

2.4 藕带多酚氧化酶提取方法的选择

2.5 藕带PPO的提取工艺和参数优化研究

3 结果与分析

3.1 提取方法对藕带PPO活性的影响

3.2 藕带PPO提取单因素试验

3.3 正交试验

3.4 粗酶液的硫酸铵分级沉淀分析结果

3.5 藕带多酚氧化酶的DEAE-52纤维素柱层析纯化

3.6 藕带多酚氧化酶的Sephadex G-100柱层析

3.7 藕带多酚氧化酶纯化过程

3.8 藕带多酚氧化酶分子量的测定

4 结论与讨论

第三章 藕带中多酚氧化酶的酶学性质及结构表征

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 PPO的酶学性质研究

3 结论与讨论

第四章 藕带保鲜初步研究

1 材料与仪器

1.1 试验原料

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 原料预处理

2.2 藕带多酚氧化酶提取与活性测定

2.3 藕带褐变度的测定

2.4 硬度的测定

2.5 藕带的护色处理

2.6 藕带的硬化处理

2.7 贮藏试验设计

3 结果与分析

3.1 藕带护色

3.2 氯化钙浓度对藕带硬度的影响

3.3 藕带贮藏过程中褐变度、多酚氧化酶活性、硬度的变化情况

4 结论与讨论

参考文献

致谢

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摘要

多酚氧化酶分布广泛,在植物、微生物、动物体内都存在,是结构复杂的含铜氧化还原酶。本文以新鲜藕带为研究对象,采用现代分离技术提取纯化藕带多酚氧化酶;并对其酶学性质,化学修饰和结构作了初步研究;对藕带的保鲜进行了试验。主要研究结果如下:
   1.藕带多酚氧化酶的提取、分离纯化及纯度鉴定本文采用4℃预冷的磷酸缓冲液提取藕带多酚氧化酶,提取条件为Tween80添加量1%,pH值6.0,提取时间为3h,料液比为1:3,所得粗酶液的活性达103U/ml。粗酶液经过30%饱和度硫酸铵除杂,80%硫酸铵沉淀,DEAM3-52纤维素离子交换层析,SephadexG-100凝胶层析等步骤,酶的总活力大幅度下降,但酶的比活力由粗酶液的21.14U/mg增加为1416.22U/mg,纯化倍数为66.99,蛋白的回收率仅为0.27%。使用SDS-PAGE凝胶电泳测定纯化后酶蛋白的分子量约为35kD。
   2.藕带中多酚氧化酶的酶学性质及结构表征以邻苯二酚为底物,藕带PPO的最适pH值为6.0,最适温度为30℃;Km为0.0344mol/L,Vm值为172.41U/ml;在30~50℃时,酶的活性比较稳定,随着保温时间的增加残存酶活性变化不大,但温度继续升高,酶活力随保温时间增加迅速降低,70℃热保温60min,PPO的活性基本丧失;抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸、氯化亚锡均能抑制藕带PPO的活性,相同浓度下抑制效果为:氯化亚锡>L-半胱氨酸>柠檬酸>抗坏血酸,至于氯化亚锡能有效抑制藕带PPO酶的机理还有待进一步研究;金属离子对酶活性研究表明:Ca2+和Al3+对PPO活性有抑制作用,其中Al3+的抑制效果强于Ca2+;其它金属离子如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+等都对PPO活性有促进作用。
   DTT对PPO二硫键的化学修饰表明:二硫键是影响藕带PPO活性的必需基团;乙酸酐对PPO氨基的修饰表明:氨基和藕带PPO的活性有重要关系;DTNB对巯基的化学修饰表明:巯基对藕带PPO的活性没有太大关系;甲醇盐酸对PPO羧基的修饰表明:羧基和藕带PPO的活性关系密切,至于修饰后PPO为什么还有部分活性还有待进一步研究。
   对藕带PPO氨基酸组成分析结合PPO分子量可推算出PPO中的氨基酸残基总和约为251个。其中非极性氨基酸残基占31.69%;极性氨基酸残基占61.04%;酸性氨基酸残基为20.74%;碱性氨基酸残基为12.66%:对藕带PPO圆二色谱分析表明:藕带PPO结构中α-螺旋占17.5%、β-折叠占61.8%、无规卷曲占20.7%。
   3.藕带保鲜研究研究表明不同浓度的L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、氯化亚锡对藕带护色都有一定效果;正交试验得出藕带最优护色组合为:柠檬酸浓度200μg/g,L-半胱氨酸200μg/g,氯化亚锡600μg/g,抗坏血酸200μg/g。烫漂护色结果显示沸水中烫漂2min对藕带的护色效果较好。对藕带进行硬化处理得出0.2%的氯化钙溶液中浸泡30min后对藕带的硬度保持较好。处理好的藕带室温贮藏表明:对于藕带的短期贮藏,护色剂护色组效果较好,若贮藏时间超过8天则烫漂护色组更能保证藕带的品质。

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