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猪水肿病大肠杆菌分离鉴定及fedF基因克隆和表达的研究

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目录

Abstract

第1章.文献综述

1.1猪水肿病的病原学

1.2毒力因子

1.3耐药性质粒

1.4猪水肿病的流行病学

1.5致病机理

1.6临床症状及剖检病变

1.7防制

第2章 研究的目的和意义

第3章 材料和方法

3.1材料

3.1.1培养基

3.1.2工具酶及主要分子生物学试剂

3.1.3质粒抽提相关溶液

3.1.4刷状缘黏及黏附抑制实验试剂配方及溶液

3.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液

3.1.6 Westernblot缓冲液

3.1.7包涵体提取用缓冲液

3.1.8引物的设计与合成

3.1.9药敏试验用试剂

3.1.10抗血清及佐剂

3.2方法

3.2.1病原分离

3.2.2生化鉴定

3.2.3药敏试验

3.2.4血清型鉴定

3.2.5致病性检测

3.2.6水肿毒素及其它毒力因子的PCR检测

3.2.7 ED3(0319)半数致死量的测定

3.2.8猪水肿病大肠杆菌地方分离株混合抗原的免疫原性研究

3.2.9 定居因子fedF亚单位基因的克隆及序列分析

3.2.10原核表达载体的构建及表达

3.2.11表达产物的生物学特性研究

第4章.结果与分析

4.1致猪水肿病性大肠杆菌的分离鉴定结果

4.2 fedF基因的克隆与序列分析

4.3原核表达载体的构建及表达

4.4表达产物的生物学特性研究

第5章 讨论与结论

5.1对致猪水肿病大肠杆菌分离鉴定的讨论

5.2对fedF基因克隆表达的讨论

5.3总结

5.4结论

6参考文献

致谢

附录

攻读硕士期间发表主要论文

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摘要

该研究分离了57株致猪水肿病大肠杆菌,对其中7株进行了形态学、培养特性试验、生化特征、致病性试验、毒力因子的PCR检测的研究.结果表明,上述7株菌形态学、培养特性试验、生化特征符合大肠杆菌,对小鼠有较强的致病性,引起小鼠死亡;7株菌肉汤培养物的无菌滤液能致死小鼠且剖检见相关脏器水肿;对7株菌主要毒力基因SLT-IIe及F18扩增,SLT-IIe全部阳性,5株F18为阳性,对LT1及ST1扩增,则全为阴性.7株药敏试验证明各菌株的耐药谱不同.7菌株感染断奶仔猪,均能复制水肿病.该研究挑选菌株ED3(O139),该菌对小鼠致病力最大,测定了其对小鼠的半数致死量(LD50),该菌对小鼠的半数致死量为2.55×10<'8>CFU.另外制备了多价灭活菌体抗原,对其小鼠的免疫原性进行了研究.我们用微量凝集法对菌体抗体进行了测定,第7天可测到抗体,效价(GMT)为1:8;28天效价达到最高为1:128;55天仍然维持较高抗体效价1:64.F18菌毛是致猪水肿病的产Vero细胞毒素大肠(VTEC)及某些产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一.菌毛F18主要亚单位有fedA、fedB、fedC、fedE及fedF,fedF基因与菌毛长度相关,并是发挥黏附功能不可缺少的因子.该研究建立了fedF的PCR检测方法,对404株致病性大肠杆菌进行了扩增,其中48株阳性,阳性率为11.9﹪.根据Genbank的序列设计两对引物,用PCR的方法扩增了大肠杆菌菌毛F18基因的主要亚基fedF的全长及去掉信号肽的亚克隆,扩增的片段大小约为1.0kb及0.9kb.将纯化的扩增产物克隆到pMD-18T中,上下游酶切位点为SacⅠ、HindⅢ,酶切分析证实所得阳性克隆,序列分析结果表明,含酶切位点的全长为967bp,鄂E株fedF基因编码区全长903bp,编码300个氨基酸的蛋白质,碱基序列同107/86株相比同源性为100﹪.与菌毛AF/R1比较,编码的蛋白质没有同源性,fedF基因高度保守,是研制疫苗的良好候选基因.用pGEX-KG构建了表达载体,SDS-PAGE表明pGEX-KG-fedFc无表达带,pGEX-KG-fedFs则有强特异性表达带,Western blot结果表明表达的蛋白质具有免疫原性.制备的抗血清具有生物学活性,能抑制菌毛F18<'+>Escherichia coli与刷状缘细胞的黏附.为基因工程亚单位苗及新型疫苗的研制打下了坚实的基础.

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