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硫氧还蛋白互作蛋白TXNIP的PPxY基序对TXNIP功能调节的结构基础

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摘要

第一章 综述

1.1 TXNIP蛋白

1.2 TXNIP与Itch蛋白

1.3 TXNIP与SH2结构域蛋白

1.3.1 SFIP2蛋白

1.3.2 Vav2蛋白

1.4 本课题的研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验仪器与实验材料

2.1.1 主要实验仪器

2.1.2 实验试剂

2.1.3 主要实验试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 目的基因的克隆

2.2.2 蛋白的表达与纯化

2.2.3 ITC

2.2.4 NMR样品制备和NMR谱

2.2.5 蛋白结晶

2.2.6 数据收集与结构解析

第三章 结果与分析

3.1 目的基因的克隆以及目的蛋白的表达和纯化

3.2 Itch的WW结构域与TXNIP的PPxY基序结合亲和力不同

3.3 WW结构域和PPxY基序多价结合具有强亲合力

3.5 Itch WW结构域识别PPxY基序的结构基础

3.6 磷酸化抑制TXNIP与Itch的结合,但是能够招募SH2结构域蛋白

3.7 SH2结构域识别酪氨酸磷酸化的PPxY基序的分子基础

3.8 基于序列和结构比对提示其他蛋白的SH2结构域也可能通过结合磷酸化PPxY基序而结合TXNIP

第四章 讨论与总结

4.1 TXNIP与Itch在体内是否以多价结合模式相互作用?

4.2 TXNIP与Vav2在体内是否有相互作用?

4.3 PPxY基序对TXNIP功能的调节作用

总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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摘要

TXNIP(硫氧还蛋白相互作用蛋白)负调节硫氧还蛋白的抗氧化活性并参与多种细胞过程。它的功能异常与多种人类疾病如糖尿病,急性髓性白血病和心血管疾病等相关。E3泛素连接酶Itch(Itchy同源物)多聚泛素化TXNIP可促使其通过泛素-蛋白酶体途径降解,这种Itch介导的多聚泛素化TXNIP依赖Itch的四个WW结构域与TXNIP的两个PPxY基序(PPCY和PPTY)的相互作用。然而,这种TXNIP与Itch相互作用的分子机制仍然不清楚。在本研究我们通过ITC实验发现,Itch的四个WW结构域中的每一个WW都与TXNIP的PPxY基序弱结合,且结合能力不同,而Itch的两两串联的WW结构域和TXNIP的串联PPxY基序的结合能力显著增强,表明多价结合模式可能是调控WW和PPxY基序相互作用的选择性及亲和力的分子机制。该结果也表明,在体内Itch可能通过串联的WW结构域如(WW1-WW2,WW3-WW4等)来识别和结合TXNIP串联的PPxY基序。此外,PPxY基序中的酪氨酸残基磷酸化(PPx(pY))将破坏PPxY基序与Itch的相互作用,而结合含SH2结构域的蛋白,如SHP2,Src,Vav2等,表明磷酸化可以作为PPxY基序功能调节的一个开关,从而调控TXNIP的降解及功能发挥。最后我们通过蛋白质结晶和X-射线衍射技术解析了高分辨率的Itch的WW3-WW4-PPCY、SHP2的SH2-PPT(pY)及Vav2的SH2-PPC(pY)的复合物结构,结构分析表明Itch的第三和第四个WW结构域可以同时识别TXNIP的两个PPxY基序,支持了Itch和TXNIP之间的多价结合模式,此外,酪氨酸残基的磷酸化将破坏WW结构域和PPxY基序的相互作用,但其却是SH2结构域与PPx(pY)基序间相互作用所必需的。

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