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实时荧光PCR检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)的研究

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第一章前言

1玉米细菌性枯萎病菌的概述

1.1玉米细菌性枯萎病菌的生物学

1.2玉米细菌性枯萎病菌的检测方法

2植物病原细菌分子生物学检测技术研究进展

2.3核酸杂交技术

2.4生物芯片检测技术

3本文的目的和意义

3.1建立玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法

第二章TaqMan探针实时荧光PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3实时荧光PCR检测方法的建立

2结果与分析

2.1实时荧光PCR体系优化

2.3实时荧光PCR检测灵敏度

2.4 PCR产物克隆

第三章结论和讨论

1关于核酸的提取、纯化与PCR抑制剂的去除

2关于PCR反应条件的优化

3关于PCR产物的克隆及序列测定

4关于实时荧光PCR

4.1影响探针检测灵敏度的几个可能因素

4.2UNG酶及实验室的核酸污染问题

4.3荧光PCR检测的优点及不足

第四章结论和创新点

参考文献

缩略语表

致谢

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摘要

该研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌检测的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法,且在国内外未见相同方法报道.将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针,除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外,还对假单胞菌属1个种,黄单胞菌属1个种,棒形杆菌属1个种,短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR.结果表明,只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,其他细菌和植原体都没有荧光产生.且绝对灵敏度比凝胶电泳高100倍,达到2.53×10<'6>个阳性分子.检测的灵敏度为10<'4>CFU/mL的菌悬浮液,相当于4个细菌细胞的基因,灵敏度高,也就是说,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR就能检测到.相对灵敏度为10<'7>CFU/mL,而且整个检测过程只需2小时,由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统,不用凝胶电泳,降低了污染.该方法特异性强、灵敏度高.可以快速、直接检测到玉米细菌性枯萎病菌,在检验检疫工作中有广阔的应用前景.

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