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呋喃丹半抗原合成与多克隆抗体制备及其检测应用

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声明

1.前言

1.1农药使用现状和残留危害

1.2氨基甲酸酯类农药

1.3呋喃丹及残留毒性

1.4氨基甲酸酯类农药残留样品前处理技术

1.5氨基甲酸酯类农药残留量分析方法

1.5.1仪器分析方法

1.5.2生物检测方法

1.5.3免疫分析方法

1.5.4生物传感器法

1.5.5荧光分析检测

1.6农药人工抗原的设计合成与抗体的制备

1.6.1半抗原的设计

1.6.2半抗原的合成

1.6.3载体的选择

1.6.4人工抗原和酶标农药抗原的合成

1.6.5抗农药抗体的制备

1.7 ELISA在农药残留检测中的应用

1.7.1 ELISA的基本原理

1.7.2 ELISA的测定方法

1.7.3 ELISA广泛应用

1.7.4 ELISA在农药残检中存在问题和应用前景

1.8研究目的和意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要试剂

2.1.2仪器

2.1.3缓冲液

2.1.4检测样品来源

2.2实验方法

2.2.1呋喃丹半抗原的设计

2.2.2呋喃丹半抗原的合成

2.2.3人工抗原的制备

2.2.4动物免疫和抗血清的采集

2.2.5最佳工作浓度的确定

2.2.6血清效价检测

2.2.7抗血清的纯化

2.2.8抗体特异性测定

2.2.9 ELISA试剂盒的初步开发研究

2.2.10样品检测

3.结果与分析

3.1半抗原分子设计与化学合成分析

3.1.1半抗原分子设计

3.1.2呋喃酚和中间产物的鉴定分析

3.1.3半抗原BFNH合成鉴定分析

3.2半抗原与蛋白质偶联和鉴定

3.2.1紫外扫描鉴定

3.2.2 BFNH-BSA红外光谱鉴定

3.3效价检测时抗原抗体工作浓度筛选

3.4活体采血前抗血清效价测定

3.5兔Ⅱ抗体纯化质量鉴定

3.6抗原抗体最佳工作条件测定

3.7抗体特异性鉴定

3.8制定呋喃丹标准浓度曲线

3.9初步开发呋喃丹ELISA试剂盒

3.9.1试剂盒的基本原理

3.9.2检测试剂盒的组成和储存

3.9.3实验设备器材

3.9.4试剂盒操作步骤说明

3.9.5数据分析

3.9.6试剂盒精密度测定

3.9.7试剂盒准确度测定

3.10茭头样品测定应用

4.讨论

附录:本文缩略词

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢

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摘要

呋喃丹(Carbofuran,2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯),学名克百威,自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫剂,广泛应用于粮食、蔬菜和水果等的害虫防治。呋喃丹能与体内的胆碱酯酶不可逆结合,从而抑制其活性,使乙酰胆碱在组织中蓄积而引起中毒。在土壤中残留呋喃丹不易降解,半衰期较长,其降解产物3-羟基呋喃丹的毒性高于呋喃丹,易造成环境污染。国家农药残留标准中已规定其在粮食和蔬菜中不得检出,但违禁使用现象仍较严重,给果蔬农产品出口经济带来严重损失。因此,建立快速、灵敏的检测方法,对加强食品安全监测,保护环境具有重要意义。本研究以呋喃丹、对硝基苯氯甲酸酯和6-氨基己酸为反应原料,避免传统的三光气化学合成工艺,合成呋喃丹半抗原:6-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。将半抗原与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备了呋喃丹人工免疫抗原BSA-BFNH和包被抗原OVA-BFNH。利用BFNH-BSA免疫家兔获得抗呋喃丹多克隆抗体,并通过间接ELISA法测定抗体效价。结果表明家兔抗血清效价达到1.28×106。根据方阵滴定筛选抗原抗体最佳工作浓度,当OD450在1.0左右时,包被抗原浓度为0.25μg·ml-1,一抗稀释倍数为1:1.6×105,羊抗兔IgG-HRP稀释1:104倍,以此作为本实验的最佳工作浓度。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,纯化抗体效价达到1.024×107,浓缩后抗体的蛋白浓度为40mg·mL-1,经10%SDS-PAGE分析,重、轻链分子量分别约为55kDa和22kDa。通过间接竞争ELISA测定不同浓度的标准呋喃丹抑制率,制作呋喃丹标准曲线,利用软件Origin7.5进行线性回归分析。在10-7~0.01mg·mL-1范围内,抑制率与标准农药浓度的线性关系显著,y=27.13+3.54X(R=0.9971),最低检测限为10-7mg·mL-1,与5种结构相似的氨基甲酸酯类的交叉反应率低于10%。开发出的快速检测呋喃丹残留ELISA试剂盒应用于茭头样品中呋喃丹残留的快速检测,表明适用于大批量样品快速初筛。

著录项

  • 作者

    朱德锐;

  • 作者单位

    华中师范大学;

  • 授予单位 华中师范大学;
  • 学科 生物化学与分子生物学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 刘德立;
  • 年度 2008
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 TQ450.263;
  • 关键词

    杀虫剂; 呋喃丹; 半抗原合成; 多克隆抗体;

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