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大豆孢囊线虫ISSRs标记的分子多样性及遗传分化

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大豆孢囊线虫(SCN)是我国大豆产区最严重的病害之一;严重影响大豆的产量和品质;已成为制约我国大豆产业发展的瓶颈。本研究选用ISSRs分子标记技术;将从核DNA水平研究中国境内大豆孢囊线虫17个不同地理种群的遗传多样性及遗传分化水平;从而阐明大豆孢囊线虫在中国的传播与扩散机制;为大豆孢囊线虫病的可持续控制提供理论依据。主要研究结果如下： （1）2009年～2017年在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、河南、江苏、安徽、湖北、浙江、福建、江西、广东、广西、贵州等17省116县开展大豆孢囊线虫病害调查;共采集336份样土;其中16省105县256份样土有孢囊线虫检出;总检出率为76.20%。我国东北大豆产区齐齐哈尔孢囊密度最大;孢囊数达366.8个/200g土;其次为松原283.0个/200g土;黄淮地区山西孢囊检出数量最多;平均孢囊数为28.3/200g土;华南等地为零星分布;偶有发生;平均孢囊数为0.8～3.5个/200g土。 （2）分离获得19个种群孢囊线虫;经形态学鉴定;认定17个种群为大豆孢囊线虫; 2个种群为旱稻孢囊线虫;扩增146头孢囊的rDNA-ITS区;测序并上传NCBI注册;用Neighbor-Joining方法聚类建树;17个群体与大豆孢囊线虫亲缘相似度达98%;2个种群与旱稻孢囊线虫为同一分支;与形态学结果一致。从ITS分子特征上;17个大豆孢囊线虫群体ITS片段的差异小于2%;2个旱稻孢囊线虫群体ITS片段的差异小于1%;表明ITS用于孢囊线虫的分类合适;是孢囊线虫DNA条形码的潜在选择基因;种群间遗传多样性与遗传分化无法体现。 （3）通过参考文献选定12条ISSRs引物;筛选出对大豆孢囊线虫扩增清晰;多态性较多引物;最终确定3条引物PTY26、PTY188和PTY888 扩增效果较好;同时建立大豆孢囊线虫ISSRs体系并对各反应因素优化。结果表明当PCR总体系为25μL;dNTPs用量为1.5μL、引物用量为0.8μL、DNA模板用量为1.2μL、DNA Taq聚合酶用量为0.34μL、10×PCR Buffer（Mg2+plus）用量为2.5μL;退火温度55℃时条带较明显且清晰;扩增效果较好;该反应体系可获得大豆孢囊线虫ISSRs清晰且多态性高的图谱以便后续研究分析。 （4）统计135头孢囊属于14个地理种群;3条引物共扩增58条谱带;50条为多态性条带;多态位点百分率（PPB）为86.21%。引物PTY26、PTY188和PTY888分别扩增不同长度条带18、19、21条;多态性条带分别15、16、19条;多态位点百分率分别为83.33%、84.21%、90.48%。结果表明供试线虫材料有很好的ISSRs多态性。 （5）对供试SCN计算遗传距离得出聚类图;并进行遗传多样性分析;结果表明：本试验中14个地理种群SCN遗传距离范围为0.0984～0.4098;齐齐哈尔和大庆的遗传相似度最低;遗传距离最大;内蒙古扎兰屯和松原的遗传相似度最高;遗传距离最小。通过软件计算出遗传相关数据;有效等位基因数（Ne）为1.3377;Nei’s基因多样性指数（He）为0.2087;Shannon’s多样性指数（I）为0.3287;14个种群总的遗传多样性Ht指数为0.2087;种群内遗传多样性Hs指数为0.0648;基因分化系数Gst指数为0.6893;表明大豆孢囊线虫的遗传变异主要存在于种群间;基因流Nm为0.2255;说明不同地理群体间基因交流较少。进行多态性分析后表明;试验所用SCN种群间地理距离不能作为遗传距离的依据;且14个种群间和种群内有较高的遗传分化和遗传多样性。 本研究结果对阐明大豆孢囊线虫的进化机理、研究大豆孢囊线虫的生理小种及毒力变化研究具有重要的理论价值和实践意义。

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