色谱质谱联用技术在蛋白质分析鉴定中的应用

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为探索蛋白质组学研究中3种不同方法鉴定蛋白质的准确性、可靠性及简便性和蛋白质序列的手工解析法在蛋白质化学中的应用,利用高效液相色谱(RP-HPLC)与电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)联用技术分别分析模式蛋白分子(牛血清白蛋白,BSA)及合成多肽粗产物.在此基础上,并以小鼠肝脏为材料经SDS-PAGE分离后用联用技术分析其膜蛋白质组.通过联用技术直接对模式蛋白分子的胰蛋白酶酶解产物进行分离和测定,从而获得系列BSA酶解片段的一级(MS)和二级(MS/MS)质谱数据,经分析软件处理后,分别通过不同处理和不同参数设置,用3种不同方法通过网上蛋白质数据库进行蛋白质搜寻鉴定.结果证明,粗产物中的主成分即为目标十三肽,另外几个主要副产物为十三肽的残缺肽或氧化肽.对色谱和生物质谱联用技术分析合成多肽的意义和副产物形成的可能机制进行了讨论.最后以小鼠肝脏为材料,运用亚细胞分离技术(蔗糖密度梯度离心)分级分离质膜,再用两性离子去垢剂(CHAPS)、非离子去垢剂(NP-40)和离液剂(chaotropes 如硫脲、尿素等)组合,综合处理细胞质膜得到膜蛋白,经SDS-PAGE分离、考马斯亮兰染色、胶内原位酶解,再通过毛细管高效液相色谱(capLC)和电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)进行色谱分离与质谱鉴定,得到的质谱数据文件运用MASCOT软件分析.结果鉴定了512个蛋白,其中有91个蛋白重复出现在不同条带上(共重复135次),所以实际鉴定出377种不同(NCBI中gi号不同)蛋白质.其中膜蛋白有88种,包括内膜蛋白和整合膜蛋白等类型.它们的分子量范围为10152Da-255882Da,pI范围为4.86-9.5.并对质膜分离进行了较为详细的讨论.

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作者
唐新科;
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作者单位

湖南师范大学;

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授予单位湖南师范大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名王贤纯,梁宋平;
年度 2004
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类蛋白质;生物化学技术;
关键词
牛血清白蛋白(BSA); 蛋白质库搜寻; 合成多肽; 质膜蛋白组; 亚细胞分离; 1D-LC-MS/MS;

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