鹦鹉热衣原体T3SS假定蛋白CPSIT_0959的鉴定及功能初步研究

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目的：
　　衣原体作为专性胞内寄生病原菌，缺乏有效机制生成一系列包括氨基酸在内的重要代谢产物，需从宿主细胞中获取营养物质以实现自身繁殖。此外，许多革兰阴性病原菌的III型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）效应蛋白与其致病性有关。本研究对鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）中预测的T3SS蛋白CPSIT_0959进行鉴定，并对其半胱氨酸脱硫酶活性、时相表达、亚细胞定位及其对衣原体感染和宿主细胞的影响进行了初步研究。这对进一步探索Cps胞内复制的营养来源及感染晚期抗凋亡机制和药物作用靶点提供了新思路。
　　方法：
　　MEGA5.0绘制CPSIT_0959进化树，利用紫外分光光度计检测该蛋白在体外的半胱氨酸脱硫酶活性，磷酸吡哆醛（5'-pyridoxal phosphate,PLP）抑制剂硼氢化钠（sodium borohydride,NaBH4）和D-环丝氨酸（D-4-amino-3isoxazolidone,DCS）验证该蛋白是否为PLP依赖性酶，圆二色谱（Circular dichroism,CD）进行确证。重组蛋白分别刺激HeLa细胞以及DCS处理后的HeLa细胞，感染Cps后间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）计算包涵体形成单位（Inclusion-forming units,IFU）以检测CPSIT_0959蛋白对Cps生长的影响。培养HeLa细胞，Cps6BC感染单层HeLa细胞6、12、18、24、36、48、60h后，收集感染各时间点总RNA和总蛋白，分别利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和免疫印迹分析技术（western blot,wb）检测HeLa细胞中CPSIT_0959mRNA和CPSIT_0959蛋白的内源性时相表达，利用IFA检测该蛋白在HeLa细胞中的定位情况及分泌情况。激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）确定蛋白定位情况。Cps6BC感染单层HeLa细胞12h后加入50μM T3SS特异性抑制剂INP0007，随后分别收集18、24、36、48、60h样本进行IFA和wb分析，并分别于感染后12、18、24h加入抑制剂，36h收集样本，IFA检测蛋白受抑制剂影响情况。不同浓度重组蛋白刺激细胞，利用IFA检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP），wb检测HeLa细胞中Fas、Fas-L、Caspase3、tBid、Bim、Caspase8的表达水平。
　　结果：
　　（1）进化树及保守结构域分析表明该蛋白为 PLP依赖性的半胱氨酸脱硫酶，体外加入PLP抑制剂NaBH4和DCS后吸收峰发生显著偏移，CD结果表明CPSIT_0959二级结构受PLP影响。
　　（2）重组蛋白刺激HeLa细胞后感染Cps，与对照组相比IFU增加，可逆转DCS引起的IFU下降。
　　（3）RT-qPCR和wb结果表明，Cps感染HeLa细胞6h后，CPSIT_0959基因开始转录，12h达到峰值，其蛋白表达于24h左右达到峰值。
　　（4）IFA显示感染24h后，CPSIT_0959主要分布于衣原体包涵体上，少量分布在HeLa细胞胞浆中，36-60h时从包涵体中释放出来，广泛分布于胞浆中。感染后48h，CLSM断层扫描、MOMP的共同定位同样证明该蛋白定位于胞浆中。
　　（5）使用T3SS抑制剂处理后，各感染时间点包涵体明显减小，CPSIT_0959定位于包涵体上，不存在胞浆中。该蛋白在感染后12-18h分泌至宿主细胞胞浆中。
　　（6）重组蛋白刺激后HeLa细胞凋亡受体途径中Fas、Fas-L表达无明显变化，Caspase8的表达水平随时间轻度增加，线粒体途径中宿主细胞凋亡相关蛋白tBid和Bim表达随时间呈递增趋势，MMP下降。
　　结论：
　　1.CPSIT_0959蛋白与其它致病性衣原体半胱氨酸脱硫酶高度同源，为具有磷酸吡哆醛依赖性的半胱氨酸脱硫酶，可逆转环丝氨酸引起的IFU减少。
　　2.CPSIT_0959在衣原体胞内生长中期阶段通过T3SS分泌至宿主细胞胞浆中，通过下调tBid和Bim的表达，进而引起MMP下降，诱导宿主细胞凋亡，增加Cps子代数量。

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作者
文雅婷;
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作者单位

南华大学;

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授予单位南华大学;
学科基础医学(病原生物学)
授予学位硕士
导师姓名吴移谋;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R374.2;
关键词
鹦鹉热衣原体; 半胱氨酸脱硫酶; 亚细胞定位; T3SS蛋白; 胞内复制;

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