抑制Beclin1促进TOCP诱导人成神经瘤SH-SY5Y细胞产生凋亡

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　　探讨自噬与凋亡在三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）诱发SH-SY5Y细胞神经毒性中的关系，进一步阐述TOCP神经毒性的作用机制。
　　方法
　　1．采用RNAi技术，构建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体；将重组质粒转染SH-SY5Y细胞，G418筛选出Beclin1稳定低表达的SH-SY5Y细胞系（sh-Beclin1细胞系），RT-PCR与Western blot检测sh-Beclin1细胞系Beclin1基因的mRNA与蛋白表达。
　　2．不同浓度TOCP（0，0.5mM）分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，MDC染色观察两组细胞系自噬泡的数量变化，Western blot检测两组细胞中LC3-II蛋白的表达。
　　3．不同浓度 TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）分别处理 SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，Hoechst33258染色观察两组细胞系细胞核形态，流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期的变化,Western blot检测两组细胞系凋亡相关基因Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表达。
　　结果
　　1．测序证实pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体构建成功。荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot技术鉴定Beclin1基因稳定敲减SH-SY5Y细胞系建立成功。
　　2．MDC染色结果和Western blot结果显示，与对照组SH-SY5Y细胞比较， TOCP(0.5mmol/L)处理sh-Beclin1细胞系48h后，产生自噬泡的数量明显减少， LC3-II蛋白表达明显降低。
　　3．与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞经不同浓度TOCP（0，1.0mM）处理48h后进行Hoechst33258染色，在荧光显微镜下可见细胞核蓝色荧光增强，染色质聚集明显，且有部分细胞出现细胞核碎裂、溶解，细胞出现典型的凋亡现象，且产生核碎裂的细胞数量随TOCP浓度升高而增加。
　　4．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，流式细胞仪检测细胞周期结果显示：与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞 G1期前有亚二倍体凋亡峰的出现，并凋亡细胞数量随着TOCP浓度增高而增多，并呈现剂量-效应关系（P<0.05）。
　　5．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示：在SH-SY5Y细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值无升高或降低趋势，Cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化，在sh-Beclin1细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值呈降低，并呈剂量-效应关系（P<0.05），cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化。
　　结论
　　1．干扰Beclin1基因的表达可抑制TOCP诱导的SH-SY5Y细胞产生自噬， Beclin1蛋白在TOCP诱导的自噬中起重要的作用。
　　2．TOCP诱发 Beclin1基因敲减 SH-SY5Y细胞系产生线粒体介导的非Caspase-3依赖的凋亡。

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作者
魏传杰;
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作者单位

南华大学;

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授予单位南华大学;
学科公共卫生与预防医学;卫生毒理学
授予学位硕士
导师姓名龙鼎新;
年度 2014
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类神经系肿瘤;
关键词
神经瘤; SH-SY5Y细胞; 三邻甲苯基磷酸酯; 神经毒性; 凋亡机理;

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