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【6h】

DcR3 siRNA活化Caspase依赖的线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡的研究

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综述诱捕受体3在肿瘤中的研究进展

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摘要

目的：
　　探讨诱捕受体（decoy receptor3，DcR3）RNA干扰对HepG2细胞体外抑制作用及诱导其凋亡机制。
　　方法：
　　实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DcR3在肝癌细胞中的表达情况；MTT法检测 DcR3 siRNA对肝癌 HepG2细胞增殖的影响；光学显微镜检测 DcR3 siRNA对肝癌HepG2细胞形态学改变；罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）双染，流式细胞术分析测定细胞线粒体膜电位和凋亡率；Caspase-9分光光度法检测试剂盒检测经DcR3 siRNA处理后人肝癌HepG2细胞中Caspase-9活性；Western blot检测DcR3 siRNA处理后肝癌HepG2细胞中线粒体凋亡信号传导通路相关蛋白细胞色素C（Cyt c）、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2等表达。
　　结果：
　　DcR3 mRNA在人肝癌HepG2细胞中表达水平是正常肝L-02细胞的3.76倍。MTT显示，DcR3 siRNA对人肝癌HepG2细胞生长有显著抑制作用，呈时间和剂量依赖性。转染40μmol·L-1DcR3 siRNA12h、24h、48h后 OD值分别为(0.26±0.03)、(0.33±0.03)、(0.35±0.02)，分别与对照组比较，差异均有统计学意义（p<0.05）；转染DcR3 siRNA（20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1）及对照NC24h后其OD值分别为(0.21±0.03)、(0.34±0.03)、(0.38±0.04)，分别与对照组比较，差异均有统计学意义（p<0.05）。形态学观察发现，DcR3 siRNA处理24h后，部分HepG2细胞变圆，体积明显缩小，胞质强嗜酸性，核固缩、深染，核染色质积聚至核膜周边，呈现典型凋亡细胞形态。Rh123/PI双染FCM检测结果显示，40μmol·L-1 DcR3 siRNA处理人肝癌HepG2细胞12 h、24 h、48 h后，HepG2细胞中Rh123荧光强度逐渐降低，凋亡率逐渐增加，呈现时间依赖性关系，与对照组相比，差异均有统计学意义（p<0.05）；40μmol·L-1DcR3 siRNA合用Ac-LEHD-CHO组（Caspase-9特异性抑制剂香荚兰醛）处理24 h后Rh123荧光强度及凋亡率与单用DcR3 siRNA处理组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。Caspase-9分光光度法检测发现DcR3 siRNA能以时间依赖方式增加Caspase-9活性，40μmol·L-1 DcR3 siRNA处理人肝癌HepG2细胞12 h、24 h、48 h后，Caspase-9活性分别为对照组的(5.4±0.4)、(7.8±0.5)和(8.9±0.7)倍，且 Ac-LEHD-CHO能拮抗DcR3 siRNA对Caspase-9活性作用。Western blot检测结果显示，40μmol·L-1 DcR3 siRNA能促进Cyt c释放，Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下调，Ac-LEHD-CHO可以拮抗上述作用。
　　结论：
　　DcR3 siRNA能抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并通过活化Caspase依赖的线粒体信号传导途径诱导其凋亡。

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