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苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及VEGF表达的影响

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目的：研究苦参碱（Matrine, Mat）对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞（rat retinal microvascular endothelial cells，RRMECs）的增殖及VEGF表达的影响，明确其可否抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖及下调VEGF的表达，为视网膜新生血管的药物防治提供新的思路和理论依据。 方法：原代培养RRMECs，取第三代细胞用于实验。MTT比色法检测不同剂量Mat作用不同时间对RRMECs增殖的抑制作用；台盼蓝染色细胞计数法测定其对RRMECs生长曲线的影响；AO/EB荧光双染色法观察细胞凋亡形态学的改变。将RRMECs按如下分组处理： （1）阴性对照组：用含20％血清DMEM培养； （2）阳性对照组：含20％血清DMEM+血管抑素 130mg/L； （3）Mat组：含20％血清DMEM+Mat 40mg/L； （4）高糖组：含20％血清高糖DMEM（葡萄糖浓度 25mmol/L）； （5）Mat+高糖组。免疫细胞化学和Western-Blotting检测不同分组处理48小时后细胞VEGF的表达。 结果： 1、MTT比色法测定结果显示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat处理RRMECs，作用24h细胞增殖抑制率分别为1.42±1.03％、11.50±1.98％、24.98±2.38％、40.27±2.49％、53.54±2.39％、63.88±3.12％;作用48h细胞增殖抑制率分别为4.16±1.14％、14.40±1.78％、33.28±1.83％、53.61±1.32％、63.53±1.96％、73.79±1.12％;作用72h细胞增殖抑制率分别为9.83±2.13％、22.17±4.29％、42.65±1.05％、63.17±1.38％、74.35±2.60％、87.24±4.59％。在5mg/L以上各试验组与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05)，各试验组之间两两比较也具有显著性差异（P<0.05)。随着浓度的增高，作用时间的增加， Mat抑制细胞增殖的作用越明显，当浓度达到40mg/L，作用48小时，细胞抑制率超过了50％。细胞计数绘制生长曲线结果与MTT结果相一致。 2、AO/EB荧光双染色法观察:在 Mat浓度达到40mg/L后处理RRMECs呈现不同程度的细胞凋亡形态学特征。 3、免疫细胞化学结果显示：VEGF表达定位于胞膜和胞浆,阳性部分为棕黄色颗粒。血管抑素（130mg/L）和Mat(40mg/L)处理后其阳性表达明显降低，灰度值越少（P<0.05）且两者作用无明显差别；高糖组的VEGF阳性表达最高，灰度值也最大，Mat(40mg/L)同样能下调其表达（P<0.05）。 4、Western-Blotting半定量检测VEGF蛋白的表达与免疫细胞化学的结果一致。 结论： 1、 Mat能有效地抑制体外培养的RRMECs的增殖，在一定的浓度和时间范围内其抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性； 2、Mat 能有效地诱导RRMECs凋亡； 3、通过免疫细胞化学和Western-Blotting证实其抑制主要是通过下调VEGF表达而发生作用的，高糖能上调VEGF的表达，Mat对高糖条件下的VEGF表达同样也有抑制作用，提示Mat对糖尿病视网膜病变等引起的视网膜新生血管防治具有一定的应用前景。

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