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DNA修复基因XRCC1和XRCC3在结直肠癌中的表达及其多态性与化疗后患者生存期关系的研究

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摘要

符号说明

1 XRCC1、XRCC3、Ki-67在结直肠癌中的蛋白表达与临床因素的相关性

1．1 前言

1．2 材料和方法

1．2．1 标本收集

1．2．2 主要试剂

1．2．3 主要仪器设备及耗材

1．2．4 实验方法

1．3 统计学方法

1．4 结果

1．4．1 XRCC1蛋白的表达结果

1．4．2 XRCC3蛋白的表达结果

1．4．3 Ki-67蛋白的表达结果

1．4．4 XRCC1、XRCC3与Ki-67蛋白相互之间的表达关系

1．5 讨论

1．6 小结

2 XRCC1和XRCC3基因多态性与接受奥沙利铂化疗后中晚期结直肠癌患者预后之间的关系

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 研究对象

2．2．2 样本收集

2．2．3 疗效评价

2．2．4 实验试剂及溶液配制

2．2．5 实验仪器

2．2．6 实验方法和步骤

2．3 统计学方法

2．4 结果

2．4．1 结直肠癌患者的5年生存率与临床病理参数之间的关系

2．4．2 基因型分布

2．4．3 基因分型与病理参数之间的关系

2．4．4 基因分型与疗效分析

2．4．5 XRCC1 Arg399Gln基因和XRCC3 Thr241Met基因之间的关系

2．5 讨论

2．6 小结

3 总结

参考文献

综述

攻读学位期间主要研究成果

致谢

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摘要

结直肠癌发病率在全球最常见的癌症中位居第三位。结直肠癌在我国的发病率虽较欧美发达国家低，但近年来随着人民生活水平的提高、饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。结直肠癌的治疗原则是以手术切除为主的综合治疗，在手术的基础上联合化疗、放疗以及靶向治疗等。由于结直肠癌起病隐匿，病情发展较慢，早期常无明显的临床表现，出现明显的症状就诊时大多已到了中晚期。因此，早期诊断、早期治疗非常关键，研究结直肠癌的发生、发展过程，为早期诊断提供依据，就成为目前亟待解决的问题。
　　外部环境因素及内在因素通过对基因载体DNA的影响而在肿瘤的发生中发挥作用。当机体不能及时有效地修复DNA损伤，损伤累积至一定程度则导致基因组的不稳定性增高，引起细胞增殖和分化失控，从而导致肿瘤的发生。DNA是生命活动中的重要遗传物质，存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，DNA会发生某些自发性的损害，还必须承受来自体内外环境的物理、化学、生物等因素的影响，因此DNA修复失败是肿瘤发生的重要原因。DNA修复系统是一个庞大而复杂的系统，和生命活动的各个方面息息相关，人们对它的了解还远不深刻。DNA修复方式主要分为错配修复(mismatch repair，MMR)、碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)、同源重组(homologousrecombination，HR)及非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)等。DNA修复能力是与肿瘤易感性和肿瘤化疗敏感性密切相关的双刃剑:DNA修复能力强，肿瘤易感性低，但对化疗有抵抗作用。
　　铂类（顺铂或奥沙利铂）联合5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)是目前治疗结直肠癌的一线方案。铂类可使DNA链局部纽结或解旋，阻止DNA聚合酶推进，致使肿瘤细胞DNA复制、转录失败，最终造成肿瘤细胞死亡，从而达到抗肿瘤作用。但在临床中发现，不同的个体的结直肠癌患者接受相同的的化疗方案治疗后，由于个体遗传之间对DNA损伤后修复能力的差异，导致化疗敏感性和毒副反应有很大的差别。DNA修复基因的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)与细胞的DNA修复和细胞周期的调控相关，并影响其修复效率，增加个体罹患肿瘤的风险，而且可以显著影响肿瘤患者的治疗效果。
　　X射线交错互补修复基因1(X-ray repair cross-complementing gene1，XRCC1)是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，它广泛参与离子辐射和化学诱变剂所致DNA损伤后的单链断裂修复(Single-strand break repair，SSBR)和BER，是与这两种修复直接相关的蛋白，并参与铂类药物等引起的DNA修复过程，在各种抗DNA阻断药物中发挥重要作用。XRCC1基因编码区存在多个导致其编码蛋白相应氨基酸改变的SNP，而这些SNP影响了XRCC1蛋白的活性。XRCC1基因Arg399Gln位点G→A的变异，导致第399密码子编码的氨基酸Arg→Gln的改变，可能降低了XRCC1修复DNA损伤的能力。X射线交错互补修复基因3(X-ray repaircross-complementing gene3，XRCC3)是酵母和哺乳动物细胞Rad51家族的成员，可修复氧化损伤引起的DNA双链断裂(double strand break，DSB)和交联损伤，在HR中DNA的DSB修复通路起重要作用。而Rad51是真核生物体内的一种蛋白质，在DNA损伤修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用。XRCC3基因Thr241 Met位点C→T的变异，导致第241密码子编码的氨基酸Thr→Met的改变，此基因的氨基酸碱基置换可能参与了去除磷酸化位点，从而影响修复功能。
　　尽管XRCC1和XRCC3基因的表达及其多态性已经得了广泛的研究，并在一定程度上证实了和不同种类肿瘤的生存期之间的相关性，但结直肠癌中这两个基因的表达及多态性与化疗患者生存期的关系研究不多，且结果存在分歧，故最终的结论尚未明确。因此，我们进行了这项回顾性分析，分别检测原发性中晚期结直肠癌患者中XRCC1、XRCC3的表达状况及其SNP，同时检测与肿瘤细胞增殖密切相关的抗原Ki-67在肿瘤中的表达，探讨EBR和HR修复在中晚期结直肠癌中的作用以及与Ki-67之间的关系以及XRCC1、XRCC3的SNP和铂类药物化疗疗效的关系，希望为中晚期结直肠癌患者的个体化用药提高疗效提供一定的理论依据。
　　第一章XRCC1、XRCC3、Ki-67在结直肠癌中的蛋白表达与临床因素的相关性
　　目的：通过检测XRCC1、XRCC3及Ki-67在结直肠癌组织和正常肠粘膜组织中的表达状况，以探讨它们在结直肠癌中的作用以及相互之间的关系
　　方法：应用免疫组织化学方法检测432例结直肠癌组织和与其匹配的切缘正常肠粘膜组织中XRCC1、XRCC3和Ki-67的表达情况，并分析三者在结直肠癌发生发展中的作用以及其与结直肠癌患者各临床病理学参数之间的关系。
　　结果：XRCC1、XRCC3、Ki-67在结直肠癌组织中的表达显著高于正常肠粘膜组织，具有统计学意义(P＜0.05)。结直肠癌组织中XRCC3与Ki-67蛋白的表达阳性率呈正相关(P＜0.05)。XRCC1、XRCC3、Ki-67在结直肠癌组织中的表达与患者年龄、性别、组织学分级、临床分期之间均无显著相关性（P＞0.05）。
　　结论：(1)结直肠癌组织中XRCC1蛋白表达上调。(2)结直肠癌组织中XRCC3蛋白表达上调。(3)结直肠癌组织中Ki-67蛋白表达显著上调。(4)结直肠癌组织中XRCC1、XRCC3蛋白表达无相关性，提示其修复功能的独立性。(5)结直肠癌组织中Ki-67蛋白与XRCC3蛋白表达呈正相关，提示两者在结直肠癌的发生发展中可能有协同作用。(6) XRCC1、XRCC3、Ki-67在结直肠癌组织中的表达与患者年龄、性别、组织学分级、临床分期之间均无显著相关性。
　　第二章 XRCC1和XRCC3基因多态性与接受奥沙利铂化疗后中晚期结直肠癌患者生存期之间的关系
　　目的：研究XRCC1 Arg399Gln及XRCC3 Thr241Met多态性对接受奥沙利铂化疗的结直肠癌患者生存期之间的关系。
　　方法：394例患者用FOLFOX方案化疗，所有患者随访从2007年5月至2012年5月。以PCR-RFLP技术检测患者XRCC1和XRCC3的基因多态性。
　　结果：(1)394例结直肠癌患者在XRCC1 Arg399Gln位点中，携带Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln基因型患者分别为184例(46.7％)、155例(39.3％)、55例(14.0％)。携带XRCC1399Arg/Arg基因型的结直肠癌患者化疗有效率明显高于其他的基因型携带者（P＜0.05）。(2)394例结直肠癌患者在XRCC3 Thr241Met位点中，携带Thr/Thr、Thr/Met、Met/Met基因型患者分别为299例(75.9％)、68例(17.3％)、27例(6.9％)，这三种基因型在结直肠癌患者中的化疗有效率分别为32.4％、30.9％、22.2％，三者之间无明显统计学差异（P＞0.05）。(3)结合低死亡风险的基因型(XRCC1399Arg/Arg和XRCC3241Thr/Thr)作为对照组，XRCC1399 Gln等位基因和XRCC3241Met等位基因的组合明显降低了结直肠癌患者的5年生存率(OR=5.24，95％CI=2.65-10.36)。(4)XRCC1 Gln/Gln、XRCC3 Thr/Met和Met/Met基因型均和结直肠癌的生存率呈负相关。(5)XRCC1 Arg399Gln基因多态性及XRCC3 Thr241Met基因多态性与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、肠系膜淋巴结转移、TNM分期状态均无显著性相关（P＞0.05）。
　　结论：(1)提示XRCC1399Arg/Arg基因型可能与接受奥沙利铂方案化疗的结直肠癌患者近期生存期呈正相关。(2)提示XRCC1399Gln/Gln基因型可能与接受奥沙利铂方案化疗的结直肠癌患者近期生存期呈负相关。(3) XRCC1399Gln等位基因和XRCC3241Met等位基因的组合，在结直肠癌的生存期中表现出显着很强的关联性，提示DNA修复基因多态性的多重效应可能对结直肠癌的预后有交互作用。(4)提示XRCC3241基因的多态性与奥沙利铂化疗的疗效无相关性。(5) XRCC1 Arg399Gln基因多态性和XRCC3 Thr241Met基因多态性与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、肠系膜淋巴结转移、TNM分期状态均无显著性相关。

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