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肿瘤型PK-M2的识别及其在急性白血病中的基本特性研究

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论文说明

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

1 材料

1.1 研究对象

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器、设备

2 方法

2.1 骨髓单个核细胞分离

2.2 CD34-CD13+细胞分选

2.3 细胞纯度的检测

2.4 蛋白质组学分析

2.5 荧光定量RT-PCR方法检测PK的表达

2.6 Western印迹实验

2.7 免疫组化检测PK-M2含量

2.8 ELISA方法检测PK-M2含量

2.9 PK活性检测

2.10 统计学分析

第三章 结果

3.1 CD34-CD13+细胞纯度

3.2 CD34-CD13+细胞蛋白表达差异

3.3 差异蛋白点肽指纹图分析结果

3.4 生物信息学分析结果

3.5 PK-M mRNA表达水平

3.6 Western印迹分析结果

3.7 PK-M2免疫组化定性分析结果

3.8 PK-M2定量分析结果

3.9 PK活性分析结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 丙酮酸激酶M2的研究进展

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢

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摘要

背景与目的:急性白血病(acute leukemia,AL)是造血干细胞克隆性病变引起的血液系统恶性疾病,由于对其发生的机制还不完全清楚,目前对其诊断和治疗仍然缺乏特异性的手段。因此,加强对AL发病机制的研究,发现白血病特异性和/或相关性分子标记,对于AL的准确诊断和靶向治疗具有非常重要的意义。为此,本研究首先筛选AL CD34-CD13+细胞差异表达的蛋白质分子,并在此基础上对初筛选出的肿瘤型PK-M2在AL的表达等基本特性进行进一步的研究,为今后更加深入研究PK-M2在AL发生中的作用、AL的诊断等奠定基础。
  方法:首先,应用免疫磁珠分选方法(magnetic active cell sorting,MACS),从AML-M2患者以及正常人分选CD34-CD13+细胞并用流式细胞术检测纯度后,采用双向荧光凝胶电泳(fluorescent two-dimensionaldifference gel electrophoresis,2-D DIGE)差异蛋白质组学技术筛选差异蛋白。随后,应用荧光实时定量RT-PCR、Western印迹、免疫组化,ELISA等方法对初筛选出的肿瘤型PK-M2在AL白血病细胞的表达、细胞分布,血浆PK-M2的含量以及血浆PK活性进行分析。
  结果:MACS分选后,AML-M2型白血病患者CD34-CD13+细胞纯度为96%,正常人CD34-CD13+细胞纯度平均为90%。2D-DIGE结果显示,在AML-M2型白血病与正常人CD34-CD13+细胞之间表达量1.1倍以上差异的蛋白质点有21个,得到15个蛋白点蛋白质肽指纹图信息,而PK-M2为其中之一,并在AML-M2型白血病细胞表达增高。实时荧光定量RT-PCR结果进一步显示,与正常相比,AML和ALL患者PK-M2 mRNA的表达增加,分别是正常的11.43和7.72倍。统计分析显示,AML和ALL与正常组之间的差异具有统计学意义,P值分别为0.002及0.028。同时,相对于正常,AML和ALL患者PK-M2蛋白也增加。免疫组化结果显示,PK-M2在AML白血病主要表达于细胞胞核,而核仁及胞浆含量较少或不表达,其在AML患者表达的阳性率为87.5%,ALL为84.6%,正常不表达。另外,AML患者血浆PK-M2水平为(10.54±15.58)IU/ml,ALL患者和正常对照血浆均检测不到PK-M2; AML组PK活性为(1.0889±0.9335)mU/ml,ALL组为(0.9736±0.4145)mU/ml,正常组为(1.8475±0.3597)mU/ml。与正常组相比,AML和ALL组PK活性具有统计学差异(P=0.012,和P=0.000),但AML患者PK活性与ALL组无统计学差异(P=0.703)。
  结论:应用蛋白质组学技术,本研究成功筛选出在AML-M2白血病CD34-CD13+细胞高表达的肿瘤型PK-M2。肿瘤型PK-M2-mRNA及蛋白质水平在AL患者的高表达,细胞核的分布以及血浆PK活性的降低,可能意味着PK-M2在AL的发生以及诊断中具有重要作用。

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