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BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的表达及对豚鼠螺旋神经元保护作用

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第一章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞正常豚鼠内耳移植的实验研究

2.1材料及方法

2.2结果

2.3讨论

第三章BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞在致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经元的保护作用

3.1材料与方法

3.2 结果

3.3讨论：

参考文献

结论

综述一骨髓间充质干细胞内耳移植的应用进展

综述二耳聋基因治疗策略

致谢

攻读学位期间主要的研究成果

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摘要

目的：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)易于分离扩增，具备多方向分化潜能，免疫源性低，可自体移植，并且有良好迁移性，暗示其在基因治疗中可能成为有价值的运载细胞。本章利用非病毒载体介导脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)转染MSCs，观察细胞转染特性和体外表达情况，建立基因工程细胞，为进一步体内研究提供基因工程细胞来源。 方法：取豚鼠的骨髓进行MSCs的分离、培养和流式细胞仪鉴定。通过比较两种非病毒载体转染方法(脂质体法和电穿孔法)，选择较好的方法介导pcDNA3.1(-)-BDNF转染MSCs并经优化浓度的G418筛选建立基因工程细胞，转染后48小时(瞬时表达)和筛选后(稳定表达)用免疫组化检测BDNF基因表达情况，RT-PCR进一步验证目的基因表达情况。 结果：成功培养MSCs，流式细胞鉴定显示各细胞表面标志表达率分别为CD44：94.65％、CD34：4.37％、CD45：7.81％。免疫组化显示脂质体介导转染的BDNF瞬时表达率约为5.80％，电穿孔法瞬时表达阳性率约为24.29％。脂质体法转染筛选14天后细胞几乎全部死亡；电穿孔法转染成功扩大培养并建立工程细胞(BDNF-MSCs)，免疫组化显示BDNF阳性表达率达90％，RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。 结论：用电穿孔法成功建立BDNF基因修饰MSCs的工程细胞，并用免疫组化和RT-PCR方法证实了工程细胞具备体外表达目的基因功能。 目的：BDNF基因修饰MSCs(BDNF-MSCs)是治疗神经退变性疾病包括感音神经性聋的潜在有效方法，但首先要明确以下三个问题：一是手术及细胞移植对耳蜗功能及结构是否造成不良影响；二是基因修饰的MSCs在耳蜗内存活和分布情况如何；最后是移植细胞在耳蜗内是否能较长时间维持表达目的基因的能力。目前还没有转基因MSCs内耳移植的报道，在此部分我们将在正常豚鼠耳蜗中对这些问题进行初步的探讨。 方法：正常豚鼠分3组，组I：为空白对照组，组II：经鼓阶开窗注射MSCs，组Ⅲ：经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs。移植细胞均经DAPI荧光标记。3个组的动物均在术前1d、术后7d及术后28d分别行ABR检测，比较各组术前、术后的ABR阈值变化；分别取术后7d及28d各组动物的耳蜗石蜡切片HE染色观察耳蜗结构；荧光显微镜观察移植细胞存活及分布；免疫组化方法检测BDNF在耳蜗内的表达情况。 结果：经鼓阶开窗移植细胞导致术后7d时ABR阈值的暂时性提高，术后28d后恢复至正常水平。耳蜗石蜡切片HE染色显示实验动物耳蜗内结构无明显异常改变。组II和组Ⅲ术后7d耳蜗切片可见荧光信号多分布于耳蜗底周的外淋巴腔(鼓阶和前庭阶)，极少量细胞能迁移到中阶及蜗轴，术后28d移植细胞存活数量有所下降，但两组动物的移植细胞存活时间均超过28d，并且BDNF基因修饰MSCs能提高移植细胞术后28d时的存活率。免疫组化显示组Ⅲ部分移植细胞表达BDNF，术后28d的阳性表达率比术后7d有显著性下降，而其余两组无阳性染色。 结论：经鼓阶开窗移植MSCs对听力的损害是轻微(<10dB SPL)和暂时的(<28d)。移植后光镜下耳蜗形态结构没有明显变化。移植细胞能存活并分布于耳蜗内各周，主要在耳蜗底周的外淋巴腔，BDNF基因转染MSCs后可以提高移植细胞的存活率。基因修饰的MSCs能在正常耳蜗内维持表达BDNF至少28d，暗示了MSCs可用作细胞载体向内耳输送BDNF治疗感音神经性聋。 目的：多种因素包括神经营养因子减少、噪音、缺血、耳毒性药物等均会导致内耳毛细胞和螺旋神经元(spiral ganglion neurons，SGNs)的直接或间接的死亡，细胞死亡主要以凋亡的形式。在前面已证明BDNF基因修饰MSCs具备体外及正常耳蜗内表达BDNF的能力，并可以在内耳中存活至少28d，本章中将进一步分析工程细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达水平(荧光定量RT-PCR)及对SGNs的保护作用。 方法：阿米卡星致聋的豚鼠随机分两组。实验组经鼓阶开窗注射BDNF-MSCs，对照组注射外淋巴液。每组均在7d及28d处死动物。荧光定量RT-PCR检测两组动物不同时间点的耳蜗组织BDNF的表达差异，并取耳蜗组织切片行TUNEL检测SGNs凋亡。 结果：实验组在术后7d和28d的BDNF表达量均显著性高于对照组，实验组术后7d的BDNF表达量是对照组的107倍，术后28d下降为33倍。实验组术后7d及28d的耳蜗SGNs凋亡指数均比对照组有显著性下降。 结论：药物致聋豚鼠内耳移植的BDNF基因工程细胞能维持表达长达28d，并能显著减少SGNs的凋亡。

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