胆碱能信号调控人视网膜色素上皮细胞自分泌功能的体外研究

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第一章人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的水平目的：体外培养人视网膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)细胞系D407，观察正常培养条件下其表达及分泌转化生长因子β2(transforming growth factor p2，TGF-β2)的水平。方法：取生长状态良好的人RPE细胞系D407，于含有10％小牛血清的DMEM培养液中常规培养(37℃，5％CO2)，收集换液后2，4，8，16，24和48小时的培养上清液及细胞，用细胞免疫化学法确定TGF-β2蛋白质的表达定位，RT-PCR及Western-blot法检测细胞中TGF-β2 mRNA和蛋白质的表达水平，ELISA法检测上清液中TGF-β2蛋白质的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果：D407细胞TGF-β2蛋白质的表达定位于细胞浆；细胞中TGF-β2 mRNA 和蛋白质的表达水平各时间点比较无统计学意义(P>0.05)；上清液中TGF-β2含量于培养4小时后开始上升，24小时达最大值，为586.9±28.Spg/mL，各时间点比较有统计学意义(F=86.593，P<0.00 1)。结论：人RPE细胞TGF-β2蛋白质的表达定位于细胞浆，RPE细胞可恒定表达并分泌TGF-β2。第二章卡巴胆碱和阿托品对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响目的：观察不同浓度的卡巴胆碱和阿托品作用下D407细胞形态学及增殖率的变化，确定两种药物适用于人RPE细胞功能学研究的浓度范围。方法：取生长状态良好的D407细胞，于含有10％小牛血清的DMEM培养液中常规培养(37℃，5％CO2)，按5×103/孔的密度接种于96孔板，贴壁后予无血清培养基孵育24小时达到同步化，将细胞分为3组：(1)卡巴胆碱组(A1-6组)：A1～A6组依次加入10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L卡巴胆碱；(2)阿托品组(B1-6组)：B1～B6组依次加入10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L阿托品；(3)对照组(C组)：不加药物，用无血清培养基常规培养。观察72小时，每24小时相差显微镜下观察细胞形态，行MTT法了解细胞增殖情况。统计学方法采用重复测量设计资料的方差分析。结果：不同浓度卡巴胆碱对D407细胞形态无明显影响，对细胞增殖有促进作用。A值随时间延长逐渐升高，各时间点比较差异有统计学意义(F=3200.150；P<0.001)；各组间比较差异有统计学意义(F=3.324；P<0.05)。LSD法显示，各时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)；A6组(卡巴胆碱浓度10-3mol/L)与其他各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。卡巴胆碱浓度与作用时间之间无交互作用(F=0.307：P>0.05)。10-3mol/L阿托品作用24小时后D407细胞出现明显皱缩、变圆，轮廓增强，胞浆内出现中毒颗粒，细胞增殖程度显著下降；48小时和72小时后部分细胞恢复正常形态，但仍可见皱缩细胞。10-8mol/L～10-4mol/L阿托品作用下D407细胞形态无明显变化。A值随时间延长逐渐升高，各时间点比较差异有统计学意义(F=6999.917；P<0.001)；各组间比较差异有统计学意义(F=25.726；P<0.00 1)，LSD法显示，各时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)；B6组(阿托品浓度10-3mol/L)与其他各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)，其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。阿托品浓度与作用时间之间存在交互作用(F=2.708；P<0.01)。结论：卡巴胆碱浓度为10-3mol/L时促进RPE细胞增殖的效应显著；阿托品浓度为10-3mol/L时可明显抑制RPE细胞增殖；卡巴胆碱和阿托品浓度在10-8mol/L～10-4mol/L范围内对人RPE细胞形态及增殖无显著影响，可用于研究其对RPE细胞功能的调控。第三章卡巴胆碱对人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的调控目的：本实验通过观察卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF-β2的时效和量效关系，研究其对人RPE细胞表达及分泌TGF-β2的调控，旨在阐明胆碱能神经递质参与近视信号的级联传递。方法：利用含有10％小牛血清的DMEM培养基中常规培养D407细胞，药物干预前换用无血清培养基(SFM)培养24小时。分为：(1)实验组(A1～5组)：A1～A5组依次加入lO-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L和10-4mol/L卡巴胆碱；(2)空白组：不加药物。分别于处理后2、4、8、16、24、48小时采用RT-PCR、Westem blot、ELISA法检测细胞胞浆中TGF-β2 mRNA及蛋白质的表达水平和上清液中TGF-β2的含量，分析时效与量效关系。统计学方法采用重复测量设计资料的方差分析。结果：D407细胞TGF-β2 mRNA、蛋白质表达水平及上清液中TGF-β2蛋白质含量均随时间延长而逐渐升高，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=4455.148，2619.21，3280.75；P<0.001)；LSD法两两比较每两组间差异均有统计学意义(P<0.001)。TGF-β2 mRNA、蛋白质表达水平及上清液中TGF-β2蛋白质含量随卡巴胆碱浓度升高亦逐渐升高，各组间比较差异具有统计学意义(F=1 102.240，2918.62，448.45；P<0.00 1)。LSD法两两比较发现，TGF-β2 mRNA表达水平A1、A2、A3组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，TGF-β2蛋白质表达水平A2、A3组及A4、A5组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，细胞上清中TGF-β2蛋白质含量A3、A4、A5组比较差异无统计学意义(P>0.05)；其余各组间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。卡巴胆碱浓度与干预时相之间存在交互作用(F=249.609，186.02，92.96；P<0.001)。结论：卡巴胆碱可促进人RPE细胞TGF-β2的表达及分泌，效应具有时间和浓度依赖性；并且该效应随时间的变化趋势受卡巴胆碱浓度的影响。提示胆碱能神经递质可能通过促进RPE细胞表达及分泌近视相关信号分子的途径参与近视信号的逐级传递。第四章阿托品对人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的调控目的：本研究通过观察不同浓度的阿托品联合10-5mol/L卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌/TGF-β2的变化，观察阿托品对RPE细胞表达及分泌TGF-β2的调控，旨在探寻阿托品延缓近视发展的可能机理及作用位点。方法：于含有10％小牛血清的DMEM培养基中常规培养D407细胞，药物干预前换用无血清培养基(SFM)培养24小时。分为：(1)实验组(A1～A5组)：依次加入10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L和10-8mol/L阿托品，孵育30分钟后每组加入10-5mol/L卡巴胆碱；(2)阳性对照组(B组)：加入10-5mol/L卡巴胆碱；(3)空白对照组(C组)：不加药物。于干预后24小时分别采用RT-PCR、Western blot、ELISA法检测细胞胞浆中TGF-βmRNA及蛋白质的表达水平及上清液中TGF-β2的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果：D407细胞TGF-β2 mRNA、蛋白质表达水平及上清中TGF-β2蛋白质含量不同干预组间比较差异具有统计学意义(F=1056.897，1320.170，475.657；P<0.001)。LSD法两两比较显示，D407细胞TGF-β2mRNA表达水平A1组、C组及A5组、B组之间差异无统计学意义(P>0.05)；蛋白质表达水平A1组、C组之间以及A3组、A4组之间差异无统计学意义(P>0.05)；上清中TGF-β2蛋白质含量A1组、C组及A3组、A4组之间差异无统计学意义(P>0.05)：其余各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论：M受体参与介导卡巴胆碱促进人RPE细胞表达及分泌TGF-β2的作用；阿托品可有效抑制卡巴胆碱促进人RPE细胞表达及分泌TGF-β2的功能。提示胆碱能M受体阻断剂可能通过此机制调控近视信号的逐级传递，从而阻断近视发展。

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作者
谭佳;
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作者单位

中南大学;

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授予单位中南大学;
学科眼科学
授予学位博士
导师姓名刘双珍;
年度 2008
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类视网膜疾病;眼科药物;
关键词
胆碱能; 信号调控; 视网膜色素; 上皮细胞; TGF-β2表达; 细胞增殖;

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